细胞冻存与复苏知识
细胞冻存的好处
节省实验室空间、我们的时间和老师的经费。
给失败的实验，多几次洗心革面的机会。
确保重复实验的一致性。
确保未来实验的连接性。
所以这看似小小的一步，其实非常重要啊！
细胞冻存的基本原理：
细胞代谢过程需要各种蛋白酶的参与，而这些蛋白酶在环境温度低于-70℃ 以下时会集体罢工，使代谢活动近乎停止，细胞因此进入睡美人状态，使细胞「不会老」，所以可以长期保存。冷冻凝固的过程中，水分会在 0℃～-20℃ 区间形成不同形状的结晶「下图 1」，因此在细胞冻存时「降温速度、冰晶形成量和细胞渗透压改变程度」是影响冻存成功与否的重要关键。
▲图1：0℃~-20℃ (红色区)，冰晶生成量最多。(Fesenmaier,2011)
■ 降温速度慢：冰晶由细胞外开始形成，造成胞外渗透压变小，细胞内水份移动至细胞外，造成细胞脱水皱缩。
■ 降温速度快：水分流动时间短，细胞内外渗透压改变程度小，但大量水分留在细内造成大量胞内冰晶形成，使胞器损坏。
这些影响都会让细胞损伤、细胞凋亡或坏死，也可能造成复苏后细胞存活率低、细胞形态改变、细胞功能丧失、基因或蛋白质组分变异等现象。由此可知，最适合的冻存条件为「在增加细胞渗透压稳定性的溶液中，以慢到能减少胞内冰晶形成、但也足够快到能预防细胞脱水的降温速度冻存细胞」「下图２」。
▲图２：降温速度对细胞造成的影响
最温柔的冻存液：
细胞冻存液体中的「抗冻剂」是维持细胞渗透压平衡的关键，常见的成分有
DMSO、甘油等。这些成分能在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，平衡细胞内外的渗透压，避免细胞过分脱水皱缩、也能同时减少细胞内冰晶的形成；但这类成分对细胞有一定的毒性，所以需要使用高浓度血清来保护细胞，使冻存成本升高。而目前市面上常见的无血清细胞冻存液，会是对细胞最温柔的替代选择。
刚刚好的冻存方法：
上课快迟到时，嫌公交车速度太慢；送暧昧对象回家时，嫌走路速度太快。到底怎样的降温速度对细胞最好？ 经研究证实：最佳降温速度为 -1℃/分钟；以下介绍三种常见冻存方法：
手动程序降温：最传统的降温法，将细胞依序放在 4℃（30 分钟）、-20℃（1 小时）、-80℃（过夜）；操作过程耗时久，容易做到一半就忘记。
程序冷冻仪：简单来说就是特殊设计冷库，内建程序能准确控温，使细胞以每分钟-1℃ 的速度降至-135℃。
程序降温盒：一般最广泛使用的降温法，为一种特制冷冻容器（填充二甲基甲醇或依靠特制金属导热），使细胞以每分钟约-1℃ 的速度降至-80℃。
快狠准地叫醒细胞：
将冻存在-196℃ 液态氮中的细胞冻存管快速移至已 37℃
预热的水浴锅中（水面需低于管口，避免水分意外进入冻存管），使细胞冷冻悬液迅速融化；此做法能让细胞冷冻悬液快速通过-20℃～0℃
这个结晶形成温度范围（图
1），使冻存时细胞外的冰晶迅速融化，避免冰晶进入细胞形成再结晶，对细胞造成二次伤害。细胞复苏速度太慢，就会像舰长一样「醒来却一身病」，电影全程出现不到半小时就下去领盒饭啦！
Reference
Fesenmaier K: Caltech Physicist Explains Why Snowflakes Are So Thin and Flat, 2011
CryopreservationGuide: The basics of cellular cryopreservation for research & clinicaluse., Biological Industries Israel Beit Haemek Ltd., 2017
