蛋白激酶D在UDP诱导的小神经胶质细胞胞吞和胞...（一）
蛋白激酶D在UDP诱导的小神经胶质细胞胞吞和胞饮作用中的功能
利用CV1000高端活细胞工作站研究蛋白激酶D在UDP诱导的小神经胶质细胞胞吞和胞饮作用中的功能
概述：CV1000高端活细胞工作站是6D、长时程的活细胞观察的最佳工具。小神经胶质细胞是一类在中枢神经系统（CNS）中发现的免疫活性细胞，他们可以迅速地对生物刺激做出反应并执行免疫功能，他们甚至可以转移至细胞中，高度繁殖且产生一些列的免疫介质。即使在健康状态，他们也会重复延伸和收缩运动不停地在自己的区域内搜索危险信号；在中枢神经系统中，小神经胶质细胞能够对脑实质进行持续不断的监视并且利用细胞外核苷酸的刺激引发它们的动态反应，可以这样说，小神经胶质细胞对组织碎片的清除对维持脑的内稳态有着至关重要的作用。小神经胶质细胞的功能会受到胞外以及胞内很多因子的调控，ATP，ADP, UDP等核苷酸因其可以在一些机体中展现出调节不同的免疫反应的功能而受到研究者的关注。通常情况下，细胞内含有高浓度的核苷酸，而胞外极低，若细胞受损，核苷酸由胞内的高浓度向胞外渗漏，并且会与胞外的嘌呤受体发生反应。已有报道，受损神经元泄露或释放的细胞外尿苷二磷酸（UDP）通过P2Y6受体活化来激发小神经胶质细胞的吞噬作用。然而，小神经胶质细胞与P2Y6受体信号的细胞内潜在机制还不清楚。 下面介绍的实验揭示了P2Y6受体的激活对于小神经胶质细胞对胞外微粒体的吞食有着促进作用。 实验具体结果如下：UDP能够在细胞膜上即时引发并持续长时间的小神经胶质细胞动态反应。UDP刺激60分钟后，细胞内包含有本位于胞外且被荧光蛋白标记的葡聚糖的液泡数量增多，这意味着胞饮作用的发生。此外，UDP诱导形成的液泡和细胞膜流动性的持续性增加还可被PKD（蛋白激酶D）的抑制剂所抑制，UDP 可以快速的诱导PKD的磷酸化以及膜转运，如果使用PKC（蛋白激酶C）的抑制剂Go6983，可使此磷酸化及膜转运终止，但Go6983却无法抑制UDP诱导的微球形成，然而另一抑制剂CID755673可以明显的抑制UDP诱导形成的对IgG毒素调理微球的吞饮作用。上述的数据揭示了PKD所调节的UDP诱导的膜运动是独立于PKC途径的，同时它也对小神经胶质细胞对液体以及微球的胞吞胞饮作用有着上调的作用。
实验目的: 揭示蛋白激酶D在UDP诱导的小神经胶质细胞胞吞和胞饮作用中的功能
实验仪器和试剂：CV1000 Cell Voyager （YOKOGAWA）活细胞工作站，ZEISS 荧光显微镜共聚焦，UDP, PMA（PKC,PKD磷酸化激活剂），CID、 Go6983、Go6976（PKC不同亚型的抑制剂）
实验对象：小神经胶质细胞
实验步骤：
1.PKD的抑制对UDP诱导形成的液泡的影响。
小神经胶质细胞先用各类PKC,PKD抑制剂孵育10分钟，之后用UDP诱导60分钟，观察液泡的形成和数量的变化，实验结果看图1。
图1
实验1总结： PKC/PKD抑制剂Go83对液泡无影响，Go76和CID可显著抑制液泡的形成。
2. PDK抑制剂对葡聚糖的胞吞以及水溶性β-淀粉的吞噬的影响。
图2
