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核酸质控设备三代全长转录组测序中的应用
全长转录本测序基于单分子实时测序 Pacbio Sequel 平台，它以长读长的优势、结合多片段文库筛选技术，实现了无需拼接的转录本分析，克服了传统二代转录组转录本拼接短、信息不完整的缺陷，可大大提高可变剪接、基因融合等分析的准确性。
当然全长转录组测序除了不能定量以外的另一缺点就是价格昂贵，因为转录组信息存在组织差异，单一组织得到的全长转录本对该物种其他部位组织可能不是很全面或不太适用，所有部位单独建库测序的成本也很高，所以用一个物种不同部位组织混样进行高深度测序，会得到相对比较全面的参考转录本库信息，也是降低测序成本的理想方法之一。
因为 Pacbio 测序的原理：直径只有几十纳米的零模波导孔，单分子的 DNA 聚合酶被固定在这个孔内，将构建好的全长转录组文库需要 loading 进去后进行测序。但是 loading 因为其对短片段的偏好性，会导致短片段占据过多数据量，而大部分长片段没有测到，因此一般会推荐构建片段分级文库。为了降低 loading 偏差的影响，构建分级文库越多，也会得到更全面的全长转录本。全长转录组测序一般推荐至少构建三种文库类型，1-2Kb、2-3Kb 和 3-6Kb 文库, 但随着 Sequel 和 Sequel II 数据产出爆炸性的增长，一般选择构建混合文库即 1-2Kb, 2-4Kb, 4-10Kb，将三部分片段进行等量混合构建一个混库测序，可选择加 Barcode 混其他样品共同测序或者单样本测序，一般推荐多片段混库数据量在 10-15 G 左右，当然测序数据量越多，检测到的全长转录本也会越全面。
影响测序产出的因素有很多，包括样品初始质量、RNA 质量、文库的质量、文库的上机定量、测序仪的状态等，因此前期的质检步骤是不可或缺的，从 RNA 提取后的质量测定，到分片段浓度和片段大小的测定和最后出库是文库的浓度和大小的测定，都是保证测序产出质量的前提。
因为文库质控高通量测序的关键步骤，它关系到测序的数据产量，会直接影响成本，在这里给大家推荐一款三代 RNA 提取、建库质控神器—Qsep100 全自动核酸蛋白分析系统。
三代建库对提取的 total RNA 的完整性要求相对较高，以 Qsep 检测为例，一般要求 RQN＞8，浓度＞300ng/ul，总量＞3ug，基线波动较小。
三代 RNA 建库过程中，需要质控的是各部分片段的大小和浓度，以便后续的各片段样品等量混合建库，以保证覆盖的均一性。另外需要质控步骤是文库的大小和浓度，为后续上机的 loading 的量提供数据，保证 loading 率以保证后续的数据产出。使用 Qsep 系列检测可以同时测定浓度和片段大小，一步到位。浓度和片段的测定的方法可参见之前的文章「浓度测定新选择，助力核酸定量」。
Qsep 系列应用于全长转录组测序的提取建库的质控优势在于哪儿呢？首先操作步骤简单，只需简单的三步即可完成（如图）。另外具有更高的通量，并且省去了很多的手动操作时间。除此之外，它们的灵敏度更高（对于检测的限制更少），并且能完全自动化的获取数据和输出电子化的数据资料。并且能同时检测片段的大小和浓度。
此外，Qsep 系列相较于其他质控仪器，其做到了可以单个样本检测不浪费试剂，单位成本更低。实现单个样品检测，极大地提高了质控的灵活性，省去了凑样的烦恼。另外对于操作人员而言，该仪器最大的特点为「容错率」高，何为容错率呢？即最大程度降低在实验过程中有些无法避免的因为操作失误或者样本原因引起的需要多次检测的这种随机性错误造成的成本增加。因为 Qsep 可以做到单样本检测，特殊原因造成的重复检测，可以当时立刻进行，不需再进行凑样，从而耽误整个实验周期。Qsep 系列可谓是完美助力三代全长转录组文库质控。
「HIFI」、「CLR」，Seuqel II 的花样更多，Qsep 系列在三代基因组文库质控方面表现如何？且看后续分析「Qsep 系列如何玩转 Pacbio HIFI 文库质控」，敬请期待！
