99% 的科研人都易忽视的核酸质控关键点

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99% 的科研人都易忽视的核酸质控关键点

2021.3.23

上图的对话经常出现在分子生物学实验室中，提取是分子实验的第一步，也是影响最终结果的最重要的因素之一，当然可能会有人不赞同，只是做简单的 PCR 实验，提取随便做做就可以扩增出很亮的条带。

文献支持
好吧，那我们先从一篇文献来看，文章作者研究了提取和文库制备方法对粪便样本中的生物多样性的影响。最终发现对结果有显著性影响是提取方法，最后提供了一种可复制的稳定的提取方法。作者使用了 21 种提取方法，并且通过提取总量（ng）和质量（片段大小）两个方面对样本质量进行排列和对比。

图 1 提取 DNA 的质量控制。从 21 种不同方法中提取 DNA 的质量 (a) 和数量 (b) 。 (a) 短于 1.8kb 的 DNA 分子百分比。 (b) 提取的 DNA 量。

如图 1 所示，其中虚线作为质量控制的关键点未能满足质量控制的方法用方框和红色字体标注。其后作者用不同提取出来的样品进行建库测序分析。得到了不同的微生物丰度的数据。

图 2 物种丰度差异对比

如图 2 所示，样品 1 和样品 2 之间所有结果表现具有一致性，但整体跟提取质量最.好的五个样品的平均值相比，革兰氏阳性菌被严重低估，革兰氏阴性菌虽有显著差异，但整体变化不大。因此，在这里量化的所有因素中，DNA 提取方案的变化对观察到的微生物组成有最大的影响。也就是初始的 DNA 质量对后续数据的结果影响十分之大。

实际案例

再说到实际案例当中，我们使用 Qsep 对不同质量的 FFPE 基因组样本进行了检测，高质量条带以 1k 为界，通过仪器给出的不同 DQN 评分对 FFPE 样本进行评价排序。如图 3 所示。

图 3 Qsep 不同降解程度 FFPE 样本检测结果

其后对这四个样品进行分批次建库，多批次结果均一致，对文库用 Qsep 进行片段检测，结果如图 4。

图 4 对应样本的文库质控结果

如图 4 所示，质量评分最低的最后一个样本，所构建文库大小显著偏小，此外文库浓度也是 4 个文库中最低，且多批次一致。因此文库质量的好坏除建库方法和过程细节外，最重要的还是初始的样本质量。文库质量的高低也影响了后续测序的结果以及数据的结果，因此做好提取样品的质控是第一步，也是最关键的一步。

应用拓展
再说到最近这一年在新冠疫情当中，一开始核酸试剂检测的假阴性问题引起了大家的关注，为什么会出现假阴性呢？是前期提取方法等问题造成核酸质量过低可能存在检测不到的问题! 检测方法并无不同，千差万别的提取方法和试剂，造成了各家核酸检测分析敏感性的差异。这里就可以看出核酸提取质控的必要性了。因此我们在做 rt-qPCR 前，可以对提取的 RNA 的质量进行质控，提高确定样本获得准确的结果的可靠性，见下图 5，可以用 Qsep 系列检测同一批次不同样品提取的 RNA，显示了不同的 RNA 样本质量。

图 5 不同质量的 RNA 检测图

另外最近三代纳米孔测序 Nanopore 也是十分火爆，Nanopore 测序仪在微生物耐药性以及致病性，环境研究，植物研究，癌症研究，临床研究，微生物组，转录组分析等领域都有大量的应用。测序芯片中集成的是具有生物活性的纳米孔蛋白，建库过程十分简单，因此想要获取高质量的测序数据，前期的提取的质量控制就特别重要。测序最长读长可达 2M, 当然读长还是要根据文库实际的长度来决定。建库之前可对样品片段进行检测确定下样本质量，选择合适的打断或者片段筛选方法。检测结果如图 6 所示，可以清晰看到整个样本分布区间。

图 6 不同质量大片段样本 Qsep 检测图

图 7 不同质量样品在 Nanopore 测序仪上的读长表现

如图 7 所示，不同质量的样品构建的文库在测序读长的表现相差较大，实际上样品提取后纯度以及长度，均会影响 Nanopore 测序的质量，包括序列的准确度以及长度。因此对于要进行三代测序的各位实验人员而言，前期对提取样品的质量控制十分重要。

那提取样品的质量控制如何进行呢? 传统上会对核酸的浓度、纯度以及片段大小进行检测，核酸浓度和纯度一般通过 qubit 和微量分光光度计进行检测，这个标准相对比较常规，不再赘述。另外核酸的片段大小，正常是通过传统的凝胶电泳进行检测，操作相对比较繁琐，另外需要人为判断降解程度，并且需要一致的上样量，染料量以及曝光度才有比较的意义。所以 Qsep 系列全自动毛细管电泳很好地解决了这个问题。让提取样品质控变得从未如此简单，它可以直观展示样品的片段大小及降解程度，并且搭配有定量试剂，可以直接检测样品浓度，初始样品质控一步到位，可以对样本降解与否或片段分布的判断给出统一的、可重复的评判标准，对后续实验的稳定和可重复性提供有力的保障。