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普渡大学陶纬国教授团队利用外囊泡分离与4D组学技术，为无创标志物筛选提供有力工具
细胞外囊泡（EVs）是细胞间通讯的重要载体，在尿液、血浆等体液中普遍存在。EVs包含蛋白、磷酸化蛋白等多种物质，参与到肿瘤等疾病发生过程，因此，EVs的高效分离及分析在标志物筛选和疾病诊断方面具有巨大的潜力。目前，传统EVs分离（如离心法、试剂盒法）各有缺陷，如耗时长、回收率差等，限制了其广泛应用，故需要一种快速、高效的细胞外囊泡分离方法。
2021年1月，美国普渡大学陶纬国教授研究团队在ACS Appl Mater Interfaces（IF 8.758）杂志上发表题为“Synergistically Bifunctional Paramagnetic Separation Enables Efficient Isolation of Urine Extracellular Vesicles and Downstream Phosphoproteomic Analysis”的研究成果，该研究基于新优化的分离方法——功能化磁珠法，高效地从尿液中分离出细胞外囊泡，该方法具有低污染、高回收率（>80%）以及分离时间短（<1h）等优点。同时，结合4D-蛋白质组、4D-磷酸化蛋白质组等新技术对前列腺癌患者和健康个体尿液外囊泡分析，找到一系列疾病相关的磷酸化蛋白质，表明其在临床研究中的巨大应用潜力。
研究材料：10例前列腺癌患者和10例健康人的尿液样本
技术方法：细胞外囊泡分离、4D-蛋白质组、4D-磷酸化蛋白质组
实验路线图：
步骤1：双功能磁珠BiMBs制备和EVs表征
步骤2：不同EVs分离方法比较分析
步骤3：尿液细胞外囊泡全蛋白质组分析
步骤4：前列腺癌尿液外囊泡磷酸化蛋白质组分析
研究结果：
1、 BiMBs制备和EVs表征分析
研究人员开发出一种新型的EVs分离磁珠：双功能磁珠BiMBs。为研究其分离效率，研究者对3种类型磁珠分离的EVs进行分析检测：仅Ti(IV)固定的磁珠（TiMBs），仅用DSPE固定的磁珠（DspeMBs）以及同时用Ti(IV)和DSPE固定的功能磁珠（BiBMs）。
通过透射电镜、纳米粒子跟踪分析技术（NTA）和蛋白质免疫印迹（WB） 等技术手段对分离的EVs的结构、粒径、EVs标志分子（CD9、CD63）进行分析。结果显示，从BiBMs磁珠洗脱的EVs具有完整膜结构，平均粒径为125.7nm，且膜结构上表达CD9、CD63蛋白。
图1 基于BiMBs分离的细胞外囊泡表征和验证
2、不同细胞外囊泡分离方法效率评估
为了与传统EVs分离方法（超速离心法、UC）进行比较，研究人员通过WB检测EVs的标志分子CD9表达强度。结果显示，BiMBs方法表现出最高的分离效率，CD9表达强度分别为：BiMBs (81%) > TiMBs (69%) > DspeMBs(61%) > UC (30%)。TiMBs和DspeMBs都是基于化学亲和原理捕获EVs，相较UC方法具有更高的分离效率，而BiMBs可进一步提高分离效率，可能是由于两个官能团的协同作用。
3、EVs全蛋白质组比较分析
研究人员进一步应用4D-蛋白质组技术对不同分离方法获得的尿液EVs的全蛋白表达进行分析，BiBMs分离的EVs鉴定到36262条特有肽段，对应3302种特有蛋白。为所有方法中鉴定量最高。将BiBMs分离鉴定到的蛋白质与ExoCarta上发表的前100种外泌体标志蛋白质进行比较发现，有95种蛋白重叠，为4种方法中与数据库重叠度最高。为进一步评估4种方法分离EVs的选择性，通过无标记定量方法对13种外泌体标志蛋白和3种尿液特异标志物进行定量分析，基于磁珠分离方法均表现出更高的信号强度，显著优于UC方法。
图2 不同EVs分离方法的蛋白质组学分析
4、前列腺癌尿液EVs磷酸化蛋白质组分析
随后，研究人员应用BiBMs分离前列腺癌患者和健康对照尿液样本的EVs，并通过4D-磷酸化蛋白质组技术分别从前列腺癌组和健康对照组中鉴定到6823条和6726条磷酸化肽段，分别匹配1564种和1413种磷酸化蛋白质。相比健康对照组，在前列腺癌组中有121种磷酸化蛋白上调表达，103种下调表达。GO分析表明，这些上调表达的磷酸化蛋白参与的生物学过程包括信号转导、蛋白质磷酸化；分子功能则与蛋白激酶活性有关。KEGG通路分析表明，这些磷酸化蛋白主要参与例如PI3K-Akt/AMPK信号通路、前列腺癌通路等。
图3 前列腺癌尿液EVs磷酸化蛋白质组学分析
小编小结：
本研究开发出一种高效且特异性好的功能化磁性纳米材料（BiMBs）应用于EVs分离，通过对EVs的捕获效率、纯度、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学的评估分析表明BiBMs的高效性及特异性。这种EVs分离策略结合4D组学技术，为无创生物标志物筛选提供强有力的工具，具有广阔的临床应用前景。
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