分享至
单细胞多组学技术揭示黑色素瘤细胞系的耐药轨迹
文章题目：Multi-omic single-cell snapshots reveal multiple independent trajectories to drug tolerance in a melanoma cell line
发表期刊：综合性一区期刊Nat Communications（IF=12.121）
发表时间：2020-05-11
1.研究背景
单细胞代谢组学/蛋白质组学能直观反映细胞动态功能的变化，是揭示细胞响应化学和环境应激的重要途径。在高维细胞状态空间中确定单个细胞的轨迹，对于理解从细胞分化到药物作用下病变细胞的表观遗传反应等生物学变化是一个突出的挑战。
本文利用单细胞蛋白质组学和单细胞代谢组学技术揭示了黑色素瘤细胞早期在药物反应和药物耐受两种状态之间变化的轨迹，并发现细胞在两种状态之间存在两条完全不同的途径。该结果对于肿瘤耐药性的研究提供了新的认识。
2.实验设计
3.分析结果
1. BRAFi处理后黑色素瘤细胞蛋白质组学和代谢组学分析
作者对细胞样本进行了0、1、3和5天（0为对照组，1、3、5为实验组）的药物治疗。与对照组相比，药物处理组中，黑色素瘤细胞转录因子(MITF, MART1)，代谢调节因子(HIF1α, p-AMPKα)，扩增标记(Ki67)等在单细胞水平的表达存在明显差异（图1 b、c）。具体来看，在药物治疗初期，葡萄糖的摄取、多数代谢调节因子、磷酸化蛋白、Ki67被抑制，这些物质的抑制反应了BRAFi对关键致癌信号通路的抑制作用。
图1 早期药物处理后M397细胞的单细胞蛋白质组学和代谢组学分析
2. 降维分析单细胞水平从药物敏感状态到耐药状态的路径变化
对经过BRAFi不同时长处理的样本，利用FLOW-MAP算法对复杂高维的单细胞数据降维处理，来可视化众多物质在单细胞水平的变化。图2中显示不同时长处理的黑色素瘤细胞呈现出不同模式的聚集，且MITF、MART1、Ki67、NGFR等蛋白的表达水平在第0天和第1天/3天到第5天耐药性上呈现出了向上和向下的分叉轨迹，也暗示从药物敏感状态到药物耐受状态存在两条通路的可能性。
图2 利用FLOW-MAP算法将单细胞数据集可视化
3. Surprisal揭示细胞时间轨迹中的不同聚集模块
为了进一步解析药物耐药性的分子变化轨迹，作者利用Surprisal分析了单细胞数据集，发现了两个主要模块（每个模块代表一组被检测物质）。单细胞中模块的影响分数表示模块中关联分析物质在该细胞中富集或抑制的程度（图3 a）。文章中发现模块1的影响分数在上下两条路径上都从负逐渐增加到正，并且在中间时间点有明显的正负变化（图3 a）。模块2的影响分数也有同样的变化模式，两个聚集模块的分隔说明在耐药发展过程中可能存在一个生物物理屏障将上下路径分隔开了。
图3 可视化展示两个主要模块的影响分数
此外，黑色素瘤细胞表型转录因子MITF及其下游蛋白MART1的表达均与模块2评分呈负相关（图3 b），这表明两条路径的分岔可能与这两种蛋白有密切关系。
4. 路径分岔的实验验证
Surprisal分析预测了从药物敏感状态到耐受状态存在上下两个路径。但是单细胞是沿着单个轨迹进行两种状态的转换还是会随机地在多个路径之间切换？文章中实验结果显示，MITF-高表达细胞显示出较高水平的Ki67和MITF丰度，并且与MITF-低表达亚群相比，有更短的扩增时间（图4 c-f）。
图4 surprisal分析表明MITF为调节路径分岔的关键转录因子
为了量化药物治疗期间MITF-高表达和MITF-低表达细胞之间随机相互转化的频率，作者在BRAFi治疗的第5天内检测了单细胞内的MITF活性。结果发现，MITF-高表达细胞中的MITF活性显示出比MITF-低表达细胞更高的活性（图5 g），没有观察到两个轨迹之间进行明显的随机切换。
图5 对BRAFi治疗5天的细胞用单细胞延时显微镜分析MITF 活性
为了进一步确认在治疗的第5天后，不同类群的细胞状态，作者量化了治疗第5天后上下通路之间差异表达的SLUG、MITF、MART1和PFK在内的多个被检测物。结果显示，SLUG、MITF、MART1和PFK在两条路径之间出现了明显的差异表达（图4 h）。此外，SLUG、MITF、MART1和PFK在MITF-低表达细胞中的表达水平显著低于MITF-高表达细胞（图4 i）。
5. 临界点分析确定了轨迹分岔调节物质
作者对单细胞数据集的Surprisal分析结果表明，在治疗的第1天到第3天中，上下通路都具有细胞状态转换的特征。
图6 两条轨迹的临界点分析和网络分析
为了识别上下两条通路上的每个临界点，作者将所有时间点的单细胞数据聚集成14个细胞类群（图6 a）。每一个类群代表一个过渡的中间状态，类群1、6、7、8、10、11和12位于上通路，2、3、9、13和14位于下通路。利用SANI和Ic来预测高维状态下的临界转变情况，作者发现上通路中细胞类群7和细胞类群9在各自路径中有最高SANI值（图6 b、c）。这表明细胞类群7和细胞类群9最接近这2条路径上的临界点。
通过对细胞类群7和细胞类群9的临界点进行网络分析，发现这两个集群的网络具有不同的结构特征（图6 d、e），表明这两个细胞类群以不同的方式调节细胞群的转变。网络中的hub节点调节物质，可能是潜在的药物靶点。在细胞类群7（上通路），作者发现了一些转录因子和代谢酶，如MITF、PFK、p-LKB、PKM2、LDH2和SLUG，在网络中显示出较高的连接（图6 f）。对于细胞类群9（下通路），TNFR、N-cadherin和p-NFκB-p65在网络中表现出高连接性（图6 f）。另外，在细胞类群7中得分高的物质在细胞类群9中得分低，反之亦然，这表明这两条路径受到不同的调节。
6. 确定干扰两条路径的物质
为了检验两条路径上的改变是否由不同的调节物质驱动，作者选择了PKM2抑制剂，NFκB抑制剂来分别干扰细胞类群7和细胞类群9，并联合BRAFi治疗分选的MITF-高表达细胞和MITF-低表达细胞亚群。结果显示，MITF-低表达细胞亚群对BRAFi+NF-κBi组合更敏感（图7 a），而MITF-高表达细胞亚群对BRAFi+PKM2i组合更敏感（图7 b）。在敲除MITF基因的M398细胞系上进行相同药物组合的检测，结果也得到了同样的结论（图7 c、d）。说明，沿着不同轨迹的细胞对PKM2和NF-κB的抑制表现出不同的敏感性。
图7 与两条轨迹相关的细胞中药物敏感性差异
考虑到这两条轨迹的调节依赖性差异，作者进一步假设，通过同时抑制PKM2和NF-κB信号传导来共同阻断这两条轨迹，可能在阻止向BRAFi耐受的转变方面表现出相加效应。为了验证这一假设，作者使用三种药物组合（BRAFi+PKM2i+NF-κBi）在体外治疗M397细胞5天，并将得到的细胞数与单药（仅BRAFi）和双药组合（BRAFi+PKM2i和BRAFi+NF-κBi）治疗5天的细胞数进行比较。与作者的预测一致，三种药物组合明显优于两种药物组合，而两种药物组合又优于单一疗法（图5 e）。这意味着这些药物可能通过选择性地阻断BRAFi诱导的细胞状态向药物耐受状态的转变而发挥作用。这些结果表明，上下通路是独立的，具有不同的调节物质，有各自对应的药物可以阻断通路。
4.研究结论
该研究通过单细胞蛋白质组学和代谢组学揭示了黑色素瘤细胞药物耐药性形成的反应轨迹，为确定有效的治疗组合提供了更准确的指导。
文献原文下载：
