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Nature Protocols上演“帽子戏法”，蛋白质组学大牛连发修饰蛋白组学新进展
景杰学术 | 报道
蛋白质翻译后修饰（PTM, Post-translational modification）包括磷酸化、糖基化、亚硝基化、甲基化、乙酰化等不同类型，几乎影响正常细胞生物学和发病机制的所有方面。深入研究蛋白质翻译后修饰对揭示生命活动的机理、筛选疾病的临床标志物、鉴定药物靶点等方面具有重要意义。应用基于质谱的修饰蛋白质组学技术，为系统水平上的蛋白质翻译后修饰研究提供了强有力的研究工具，已成为近年来国际上的研究热点。然而，基于蛋白质翻译后修饰的不均一性及相对丰度低的特性，PTMs的精确定量面临诸多挑战。
近日，国际专业学术期刊Nature Protocols（IF=10.419）上接连发表了三篇修饰蛋白质组学最新文章。来自军事科学院军事医学研究院、国家蛋白质科学中心（北京）的杨靖研究员、贺福初院士、徐平研究员团队，瑞士联邦理工学院Ruedi Aebersold和Matthias Gstaiger 研究团队，约翰霍普金斯大学医学院杨伟明、张慧团队等蛋白质组学领域杰出科学家陆续发表了关于半胱氨酸蛋白质组、蛋白质复合物组学、O-GalNAc糖蛋白组分析的新方法策略。
1. 氧化还原反应性半胱氨酸蛋白质组的定量巯基反应谱分析半胱氨酸具有高亲核性，可通过多种氧化还原修饰机制（如亚硫酸化、谷胱甘肽化等）可逆地改变蛋白质的结构和功能。作为一种关键的细胞信号机制，其可参与多种重要的生物学过程，如脂肪代谢产热，昼夜节律，白细胞募集，神经元兴奋和DNA损伤修复等。测量蛋白质半胱氨酸对氧化还原扰动的反应，对于理解其潜在机制至关重要。
近日，来自军事科学院军事医学研究院、国家蛋白质科学中心（北京）的杨靖研究员、贺福初院士、徐平研究员等在Nature Protocols上发表题为A quantitative thiol reactivity profiling platform to analyze redoxand electrophile reactive cysteine proteomes的论文，报道了一个称为“QTRP”（quantitative thiol reactivity profifiling）的化学蛋白质组学新策略。该研究基于硫醇反应探针IPM（2-iodo-N-(prop-2-yn-1-yl)acetamide） 共价标记及富集，定量了细胞和组织中的反应性半胱氨酸。
该方法流程主要包括：（1）用IPM标记细胞或组织样本（例如对照组与治疗组）的反应性半胱氨酸；（2）将蛋白质样品加工成胰蛋白酶肽，并通过
运用QTRP方法，能够识别和量化>5000个不同的修饰肽序列。该方法的样品制备方案需要3天时间，而质谱测量和数据分析分别需要75分钟和<30分钟，有望在氧化还原生物学、化学生物学和制药工业中得到广泛的应用。
QTRP方法概述
2. 基于SEC-SWATH-MS定量的复合物蛋白质组分析策略细胞的大多数催化、结构和调节功能都是由功能性的蛋白质复合物完成的，这些复合物的组成、丰度以及特定蛋白质在不同功能模块间的定量分布，均在基础生物学和翻译生物学中具有重要意义。然而，在蛋白质组范围内检测和量化蛋白质复合物在技术上具有挑战性。
瑞士联邦理工学院Ruedi Aebersold和Matthias Gstaiger 研究团队在Nature Protocols上发表题为Complex-centric proteome profilingby SEC-SWATH-MS for the parallel detection of hundreds of protein complexes的论文。该研究开发了一种基于SEC-SWATH-MS定量的复合物蛋白质组分析（策略，能够捕获大多数处于复杂组装状态的蛋白质，并揭示了它们在相应的细胞状态下是如何组装成为数百个复合物和复杂变体的。
该策略将靶向蛋白质组学的基本原理扩展到了天然蛋白质复合物分析上，其主要步骤包括：（1）以SEC色谱方法（ size exclusion chromatography）的蛋白质复合物分馏为基础，提高了色谱分辨率，（2）通过DIA质谱技术（data-independent acquisition）对分离到的肽段进行精确定量，（3）基于来自泛型蛋白质相互作用图的先验信息，通过CCprofiler检测（https://github.com/CCprofiler/CCprofiler）和定量蛋白质复合物。
与其他方法相比，该方法能够以前所未有的分辨率并行检测和量化数百种蛋白质复合物，并具有发现不同生物过程中模块化蛋白质组功能新方面的巨大潜力。随后，基于蛋白质组分析结果，可选择蛋白质复合物进行进一步的下游表征，例如通过验证复合物变体的存在等。该方案适用于培养的细胞，也可能适用于原代组织。
技术流程示意图
3. O-GalNAc糖蛋白组的大规模位点特异性定位分析蛋白质糖基化是最常见的蛋白质修饰之一，O-GalNAc是糖基化的一个主要类型，被认为在蛋白质折叠、稳定性、运输以及蛋白质相互作用中起重要作用。识别位点特异性的O-GalNAc糖蛋白组是理解修饰的生物学意义的关键。然而，由于缺乏合适的方法学，研究者们对O-GalNAc修饰位点和复杂的O-GalNAc聚糖结构缺乏共识，这给在复杂生物样品中的大规模定位分析带来了挑战。
来自约翰霍普金斯大学医学院的杨伟明（Weiming Yang）、张慧（Hui Zhang）团队在Nature Protocols上发表题为 Large-scale site-specific mapping of the O-GalNAc glycoproteome的论文。该研究报道了团队开发的基于质谱技术的 EXoO技术策略（extraction of O-linked glycopeptides），能够从复杂样品中识别和定量来自数百种糖蛋白的数千个O-GalNAc基化位点，以及与位点特异性O-GalNAc聚糖相关的信息。
EXoO技术方法可分为7个阶段：（1）蛋白质的提取和蛋白水解成肽；（2）肽的连续胍化和脱盐；（3）糖肽的富集；（4）固相肽偶联，使用 OpeRATOR蛋白酶释放O-GalNAc糖肽；（5）液相色谱-串联质谱联用技术分析O-GalNAc糖肽；（6）数据库检索法鉴定O-GalNAc糖肽；（7）O-GalNAc糖肽的定量。
目前已报道的现有方法最多可以报告几百个O-Galnacylization位点的定位，并主要适用于细胞系分析。与之相比，EXoO方法绘制了3000多个O-Galnacylization位点，并且可用于研究培养细胞和临床样本。此外，EXoO方法中使用到的OpeRATOR蛋白酶能够有效地分割密集的O-GalNAc聚糖位点，因此针对含有密集的O-GalNAc聚糖簇合物的蛋白质（例如粘蛋白型糖蛋白）的研究也具有独特的优势，特别适用于研究真核细胞发育中的粘蛋白型糖蛋白和癌症等疾病。
EXoO研究策略的工作流程图
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参考文献：
1. Ling Fu, et al., 2020. A quantitative thiol reactivityprofiling platform to analyze redox and electrophile reactive cysteineproteomes. Nature Protocols.
2. Isabell Bludau, et al., 2020. Complex-centricproteome profifiling by SEC-SWATH-MS for the parallel detection of hundreds ofprotein complexes. Nature Protocols.
3. Weiming Yang, et al., 2020. Large-scale site-specific mapping of the O-GalNAc glycoproteome. Nature Protocols.
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