治疗性蛋白药物生物分析技术分享 ---ProteinSimple 2021年中国药学会医药生物分析学术年会参会后记

ProteinSimple

2021.6.21

由中国药学会医药生物分析专业委员会主办，中国生物分析论坛（CBF）承办的2021年中国药学会医药生物分析学术年会，于2021年6月18-20日在苏州成功举办。本次会议主要围绕小分子药物和大分子药物的PK/PD为主题展开，重点介绍了相关领域的研究进展，特别是生物大分子药物、新型基因与细胞治疗药物的生物分析。ProteinSimple作为创新型蛋白质分析技术品牌亮相于此次大会，展示了多款创新性生物分析工具（如Ella微流控ELISA技术）在药物研发PK/PD和生物标志物开发中的应用案例和进展，受到了与会嘉宾的关注。治疗性蛋白药物是一类以分子量不同的多肽到蛋白质为基本构成的生物制品。治疗性蛋白药物的生物分析（体内药物分析）包括药代动力学（Pharmacokinetics, PK）、毒代动力学（Toxicokinetics，TK）、药效动力学（Pharmacodynamics, PD）和免疫原性（Immunogenicity）等。药物代谢动力学（PK）是定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄规律，并运用数学原理和方法阐述血药浓度随时间变化的规律。对于一些治疗性蛋白药物如单抗药物（以IgG为例）或者融合蛋白，影响其PK的主要因素有：

靶向新生儿Fc受体（FcRn）对PK的影响

血液中循环的IgG被内皮细胞或单核细胞通过液相胞饮作用或受体介导的内吞作用吸收。一旦进入细胞，IgG就会与酸性内体中的FcRn结合。与FcRn结合的IgG逃脱溶酶体降解并迁移到细胞表面，IgG遇到生理(~pH7.4)pH环境并被释放回血液。未与FcRn结合（由于其他IgG的竞争）的IgG将被分类到溶酶体进行降解。通过与FcRn竞争结合循环，机体可以调节IgG稳态：当存在大量IgG时，更多的IgG将被分类到溶酶体进行降解，而当IgG浓度低时，更多的IgG将通过再循环捕获。

使Fc区中某些氨基酸突变，可以使其在pH6下显着增强与FcRn结合而同时在中性pH(7.4)下保持很少或没有结合的突变。据报道，特定的Fc变体（T250Q/M428L, V308P, M428L, M252Y/S254T/T256E, M428L/N434S, N434A, N434H）在pH6时提高IgG对FcRn的亲和力，而在中性pH下与 FcRn 很少或没有结合。FcRn结合亲和力是治疗性mAb的关键质量属性(CQA)之一。mAb中的甲硫氨酸可以在生产过程中被氧化。人IgG1的Fc区具有三个保守的甲硫氨酸残基（Met252、Met358和Met428），它们位于FcRn结合的CH2-CH3界面附近。有研究表明，这三个Met残基的氧化会削弱Fc-FcRn的结合。尽管Fc的CH2-CH3 结构域主要参与与FcRn的结合，但Fab的可变区(Fv)也可能与FcRn 相互作用并改变IgG分子与FcRn之间的相互作用。有研究发现尽管具有相同Fc和不同Fab的mAb在pH6和pH7.3都表现出与FcRn的不同结合，但只有pH7.3下的解离特征与这些 mAb的体内PK特性相关（在pH7.3时解离越慢，半衰期越短）。

糖基化对PK的影响

有研究表明具有末端高甘露糖聚糖的糖基化mAb已显示出从血液中快速清除。临床研究也证明了对含有高甘露糖的mAb的快速清除。归因于体内糖蛋白去除的聚糖受体包括甘露糖受体(ManR) 和去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。

等电点（pI）对PK的影响

一般来说，通过化学或基因改造来获得更高、更碱性的pI值的抗体表现出粘附在细胞表面阴离子部位的高倾向，导致组织吸收增加和快速清除循环。相比之下，具有较低、更酸性pI值的修饰抗体具有较低的细胞吸收率（由于对带负电荷的细胞表面的排斥），导致组织吸收降低。控制mAb的pI也被用于降低免疫毒素的毒性。有研究降低免疫毒素fv部分的pI显著降低肝脏毒性，可能减少对肝脏的分布。有研究表明当酸性变异体与碱性变异体的差异小于一个pI单位的差异对PK大多无关紧要，但大约一个pI单位或以上的等电点的变化可能在pk和组织分布上会产生变化。

对靶点介导的药物处置模型（TMDD）对PK的影响

靶点介导的药物处置模型（Target-mediated drugdisposition, TMDD）是一种非线性PK现象，其中药物靶结合（与受体、酶或转运体的结合）和随后的解离、药物靶复合降解等导致PK的剂量依赖性变化。在低浓度下，TMDD占mAb清除的重要部分。随着mAb浓度的增加，靶标介导的消除开始饱和，清除率急剧下降。TMDD引起的非线性PK可能对研究设计（临床前和临床）产生重大影响，特别是对剂量选择、给药方案和采样时间。必须在药理学相关物种中进行怀疑TMDD的mAb的临床前PK研究，以确定药物是否受到TMDD的影响。然而，结果也可能会受到抗药抗体(ADA)干扰的影响。最好用PD测量进行PK研究，以估计暴露和反应关系，并确定PK饱和剂量是否也是PD饱和的剂量。

抗药抗体（ADA）对PK的影响

大多数的治疗蛋白都是免疫原性的，可以诱导人类体内产生抗药抗体（Anti-drugAntibody, ADA）。治疗性蛋白药物的免疫原性可引起过敏反应和输液反应等过敏反应，并加速药物清除，导致安全性和疗效降低。ADA发生时，使得很难解释PK/TK数据，特别是当怀疑是TMDD时。因此当同时怀疑ADA和TMDD是否影响PK时，需测量动物血清或血浆中的ADA水平。

非靶点结合对PK的影响

虽然针对抗原开发的抗体对该抗原具有高度特异性，但一些mAb可以对不相关的抗原具有多特异性结合能力。因此非靶点结合会显著影响治疗性抗体的PK、组织分布、疗效和毒性。由于非靶结合的不可预测性，建议候选的mAbs的在体外进行早期筛选以进行非靶结合实验进行分析。

治疗性蛋白药物的PK分析方法需具备在复杂生物基质中检出和监测（追踪）被分析物（母体药物和/或代谢物）的能力，同时应还满足特异性、灵敏度、准确度和精密度以及适当的定量范围等要求。酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是治疗性蛋白药物用于药代动力学(PK）和抗药物抗体(ADA)分析中最广泛使用的免疫分析方法。但传统的ELISA存在动态范围窄，操作繁琐，板内和板内CV值大，样品上样量大（稀缺样本）等缺点。

Ella是ProteinSimple公司推出的快速、精准、重复性高的全自动ELISA快检系统，可有效克服传统ELISA技术的缺陷。Ella推向市场以来，已被Genentech，Pfizer，PPD，Covance等众多制药公司及CRO用于新药临床研究，同时也被NIH，耶鲁，斯坦福大学等用于转化医学，诊断试剂开发，多批次大样本人群筛查等，相关结果发表在Cell等顶级杂志。罗氏制药研发中心曾发表文章：“Use of Ella^® to facilitate drug quantification and antidrug antibody detection in preclinical studies”，中指出：

A human therapeutic IgG quantification assay was successfully transferred from ELISA to the Ella^® platform. An antidrug antibody (ADA) immune complex assay was successfully transferred to the Ella^® platform. 临床前样本的药代动力学（PK）和抗药物抗体（ADA）分析已成功将ELISA系统转移到Ella平台；
Both Ella assays were superior to the corresponding ELISA assays in terms of sample consumption, dynamic range and degree of automation. 在样品消耗、动态范围、自动化程度，Ella测定均优于Elisa测定；
The Ella platform is a promising tool for the analysis of preclinical samples. Ella将成为临床前药物定量和检测ADA有前途的一项检测平台。