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如何入局多组学实验？4D-蛋白组+代谢组双平台知识干货带您入门！
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「如何入局多组学实验？4D-蛋白组+代谢组双平台知识干货带您入门！」
多组学联合分析已成为生命科学研究常用的工具，而高通量普通转录组测序技术研究已得到大规模的应用，很多课题都被研究过，导致课题创新性不高，而且部分基因不一定会表达，使得验证实验难以进行。为了寻找、验证基因下游的功能，很多研究者纷纷使用下游的蛋白组和代谢组技术，发表高分文章。
如2019年9月特拉维夫大学Tamar Geiger教授团队和Sheba医疗中心的Gal Markel团队合作在Cell发表的题为“Proteomics of Melanoma Response to Immunotherapy Reveals Mitochondrial Dependence”的研究成果，通过蛋白质组学技术和功能验证，发现了黑色素瘤细胞的代谢状态通过抗原呈递机制的内在变化和肿瘤微环境的外在变化影响了T细胞杀伤，揭示了黑色素瘤代谢状态与免疫治疗响应之间的关联，这可能有助于将来改善免疫治疗响应[1]。
2020年12月蛋白质组领域领军科学家Matthias Mann团队(Max Planck Institute of Biochemistry)、Hannes Röst团队(University of Toronto)、Ben Collins团队（ETH Zurich）以及Ruedi Aebersold团队（ETH Zurich）在Nature methods发表题为“diaPASEF: parallel accumulation–serial fragmentation combined with data-independent acquisition”的文章，其共同开发的基于4D平台的DIA技术——diaPASEF，能够全面提升蛋白质鉴定覆盖率、重现性和定量准确性[2]。
2021年1月9日，西湖大学生命科学学院郭天南课题组与合作团队在Cell在线发表了题为“Multi-organ Proteomic Landscape of COVID-19 Autopsies”的最新研究论文，报道了2020年初因新冠肺炎去世的患者体内多器官组织样本中蛋白质分子病理全景图。相当于他们将医生在显微镜下看到的人体感染新冠后细胞组织的改变放大了数万倍，达到蛋白质分子层面，“看”清楚是哪些分子的改变导致人体器官的病变和衰竭[3]。
2020年5月27日，西湖大学郭天南团队、温州医科大学台州医院陈海啸团队等在cell发表题为Proteomic and Metabolomic Characterization of COVID-19 Patient Sera的研究。该研究运用高分辨率质谱设备取得了样本的蛋白质组学和代谢组学谱图，对血清样本中的蛋白和代谢物的相对浓度进行了全景式的测定，从而揭示了重症患者体内多种独特的分子调控。同时，使用机器学习方法进一步“沙里淘金”，筛选出重症患者特征性的22个蛋白质和7个代谢物。这一发现有望用于重症患者的预测，促进医疗资源的合理调配，并为重症患者的药物选择提供一定指导[4]。
「那么，开展蛋白组学和代谢组学实验有何技巧，未做过的老师又该如何入局呢？」
入门前先学技术
蛋白组学和代谢组学爆火的背后隐藏着质谱技术的更新换代和科研市场的风向，在入局前各位老师还是需要了解最新的质谱技术、各项技术的优劣势。
#01
蛋白组学
近年来色谱、质谱等技术突破，尤其是结合Tims-TOF Pro系统和Evosep One色谱系统的4D高通量蛋白组学技术，是目前最新的蛋白组学技术，它实现了更高通量和定性定量可靠性。4D-Proteomics™是在3D分离即保留时间（retention time）、质荷比（m/z）、离子强度（intensity）这三个维度的基础之上增加了第四个维度，离子淌度（mobility）的分离，进而大幅度的提高扫描速度和检测灵敏度，带来蛋白质组学在鉴定深度、检测周期、定量准确性等性能的全面提升。
图1 | 4D蛋白组示意图
图2 | 4D蛋白组原理图
4D蛋白组的分类
常规的4D蛋白组根据技术方法可以细分为4D-DIA、4D-LFQ、4D-ITRAQ/TMT以及4D-PRM等，修饰类型的4D蛋白组可以根据蛋白具体的修饰类型划分为磷酸化、泛素化、乙酰化、糖基化蛋白组等。
图3 | 4D蛋白组分类
4D蛋白组技术优势
（1）近乎接近100%的离子利用率，提升检测灵敏度；
（2）更高的检测深度和覆盖度；
（3）完整性、可靠性全面提升；
（4）定量重复性高
#02
代谢组学双平台
在代谢组技术上，GC-MS和LC-MS质谱平台灵敏度及偏向性不一样，两个平台之间具有互补性。LC-MS平台对代谢物的覆盖最广、灵敏度更高，相比于GC-MS，无需衍生处理，偏向于氨基酸、有机酸、小分子糖类、挥发性物质的检测，可以定性到的代谢物在200个以上。GC-MS平台可以检测到的物质峰可以达到几千甚至上万，有定性信息的物质在1000个以上，偏向于脂质、胆汁酸、黄酮酚类、部分氨基酸、糖类等物质检测。鹿明生物通过优化的前处理方法并结合GC-MS和LC-MS平台各自优势，同时配套多年积累的拥有自主产权的自建数据库，实现一份样本双平台检测，极大地提高了代谢物鉴定的数量和准确性。
代谢组学双平台流程图
代谢组学的分类
代谢组学双平台的优势
1.性价比高，一份价格双平台结果；分析丰富，单/多维统计分析、相关性分析、通路分析、个性化分析。
2.覆盖度广，从初级到次级代谢物全面覆盖；
3.数据库全，拥有自主产权GCMS LUG库（2000+）&医学类LCMS自建库EMDB（3600+）&植物类LCMS自建库PMDB（6000+）；
4.质控严格，从样本前处理质控，到残留评估、组间质控、组内质控、数据处理质控五大质控过程为结果保驾护航；
#03
4D蛋白组和代谢组双平台联合分析
生命体的网络调控机制非常复杂，单一组学实验虽然可以解释或者发现一定的生物现象，但往往有一定的片面性，不能全面描述生物功能的分子机制，从而给科学家造成一定的困扰。对蛋白组和代谢组两个分子层次的组学数据进行整合分析，一方面可以结合两个组学的分析结果，进行相互验证，提高后续实验验证成功率；另一方面也有助于相互补充，并且使研究更加系统。最终实现对生物变化大趋势与方向的综合了解，提出分子生物学变化机制模型，并筛选出重点代谢通路相关的蛋白质或者代谢产物，从而为后续进行深入实验与分析提供数据基础。联合分析的应用方向有如下4个，供参考。
Biomaeker研究
分子分型研究
调控机制研究
药靶与药物发掘研究
#04
如何跟上多组学实验研究？
当下，虽然4D蛋白组和代谢组学联合分析比较火热，但是也不是谁都能轻松入局，分一杯羹的。
科学研究的创新性、完整性、研究的深度，以及生命科学的复杂性，导致其本身是一个慢出成果的事情。若是老师前期的基础工作比较扎实了，包括前期发表的文章和针对现有的预实验结果都有很好的结果，那可以去考虑开展多组学实验，做机制研究。若没有前期基础，可以待基础实验完善后再考虑，或者做一点简单的标志物筛选实验。
鹿明生物在多组学和生物标志物及机制研究有比较多的项目经验，欢迎长按扫码咨询鹿明生物技术工程师，帮您更详细的提供对应研究方案~
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参考文献：
[1]Harel M, Ortenberg R, Varanasi SK, Mangalhara KC, Mardamshina M, Markovits E, Baruch EN, Tripple V, Arama-Chayoth M, Greenberg E, Shenoy A, Ayasun R, Knafo N, Xu S, Anafi L, Yanovich-Arad G, Barnabas GD, Ashkenazi S, Besser MJ, Schachter J, Bosenberg M, Shadel GS, Barshack I, Kaech SM, Markel G, Geiger T. Proteomics of Melanoma Response to Immunotherapy Reveals Mitochondrial Dependence. Cell. 2019 Sep 19;179(1):236-250.e18. doi: 10.1016/j.cell.2019.08.012. Epub 2019 Sep 5. PMID: 31495571; PMCID: PMC7993352.
[2]Meier F, Brunner AD, Frank M, Ha A, Bludau I, Voytik E, Kaspar-Schoenefeld S, Lubeck M, Raether O, Bache N, Aebersold R, Collins BC, Röst HL, Mann M. diaPASEF: parallel accumulation-serial fragmentation combined with data-independent acquisition. Nat Methods. 2020 Dec;17(12):1229-1236. doi: 10.1038/s41592-020-00998-0. Epub 2020 Nov 30. PMID: 33257825.
[3]Nie X, Qian L, Sun R, Huang B, Dong X, Xiao Q, Zhang Q, Lu T, Yue L, Chen S, Li X, Sun Y, Li L, Xu L, Li Y, Yang M, Xue Z, Liang S, Ding X, Yuan C, Peng L, Liu W, Yi X, Lyu M, Xiao G, Xu X, Ge W, He J, Fan J, Wu J, Luo M, Chang X, Pan H, Cai X, Zhou J, Yu J, Gao H, Xie M, Wang S, Ruan G, Chen H, Su H, Mei H, Luo D, Zhao D, Xu F, Li Y, Zhu Y, Xia J, Hu Y, Guo T. Multi-organ proteomic landscape of COVID-19 autopsies. Cell. 2021 Feb 4;184(3):775-791.e14. doi: 10.1016/j.cell.2021.01.004. Epub 2021 Jan 9. PMID: 33503446; PMCID: PMC7794601.
[4]Shen B, Yi X, Sun Y, Bi X, Du J, Zhang C, Quan S, Zhang F, Sun R, Qian L, Ge W, Liu W, Liang S, Chen H, Zhang Y, Li J, Xu J, He Z, Chen B, Wang J, Yan H, Zheng Y, Wang D, Zhu J, Kong Z, Kang Z, Liang X, Ding X, Ruan G, Xiang N, Cai X, Gao H, Li L, Li S, Xiao Q, Lu T, Zhu Y, Liu H, Chen H, Guo T. Proteomic and Metabolomic Characterization of COVID-19 Patient Sera. Cell. 2020 Jul 9;182(1):59-72.e15. doi: 10.1016/j.cell.2020.05.032. Epub 2020 May 28. PMID: 32492406; PMCID: PMC7254001.
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END
晓彬 撰文
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