4D蛋白组学揭示SARS-CoV-2感染过程中的肺泡屏障损伤新机制

精准医学与蛋白组学

2021.10.20

景杰学术 | 报道

新冠疫情的爆发业已造成大量人员感染、死亡，是人类有史以来在健康领域所遇到的最大挑战之一。肺脏是SARS-CoV-2感染的主要靶器官，感染将导致严重的肺泡结构和功能损伤。探究SARS-CoV-2感染过程中肺泡损伤机理，有助于提升对于新冠肺炎病毒的理解，促进针对性的抗病毒药物开发。

近日，中科院大连化物所研究团队在专业学术期刊Cell Death & Disease（IF=8.469），运用全新一代4D蛋白质组学技术和生物成像技术，探究了在共培养体系下，肺泡上皮细胞及其邻近微血管内皮细胞对SARS-CoV-2病毒感染的反应，及两者在病毒感染过程中的关联，揭示了感染对于肺泡上皮细胞和肺微血管内皮细胞的损伤机理。景杰生物为该研究的4D蛋白质组学分析提高技术支持。

研究发现，SARS-CoV-2主要感染肺泡上皮细胞，在入侵过程中，SARS-CoV-2通过调控宿主细胞蛋白组及重塑其细胞器的方式，挟持其细胞机制完成病毒的大规模复制。同时，定量蛋白组结果显示，SARS-CoV-2感染肺泡上皮细胞后，可激活其抗病毒和先天免疫反应，上调促炎细胞因子表达，如IL-1α和干扰素。这些细胞因子释放到细胞外空间，并进一步诱发相邻肺微血管内皮细胞的损伤，最终导致肺泡-微血管屏障破坏。

实验思路

肺是SARS-CoV-2攻击的主要靶器官。为了在体外重构肺的基本功能单元——肺泡，研究人员在transwell进行肺泡上皮细胞和肺微血管内皮细胞共培养，以模拟肺泡-微血管屏障。在肺泡侧加入SARS-CoV-2模拟病毒经由呼吸道入侵肺脏。72小时后，分别收取肺泡上皮细胞和肺微血管内皮细胞蛋白样本和细胞样本进行蛋白组学和细胞成像分析，在蛋白组学水平和亚细胞水平探究SARS-CoV-2感染对于肺泡上皮细胞和肺微血管内皮细胞的影响。并根据组学信息中异常调控的通路或蛋白，进行针对性的靶向药物筛选，评价其抗SARS-CoV-2感染能力。

图2. 实验流程图

文献精读

SARS-CoV-2病毒感染的4D蛋白质组学分析

研究人员使用SARS-CoV-2感染肺泡上皮细胞-肺微血管内皮细胞共培养体系72小时，分别收取肺泡上皮细胞和肺微血管内皮细胞样本，运用全新一代4D-LFQ蛋白质组学方法进行定量分析（图3A）。生信分析显示，在肺泡上皮细胞中，病毒感染导致300个蛋白表达异常(76个上调蛋白；224个下调蛋白) (图3B); 而在肺微血管内皮细胞中，感染组有256个蛋白表达受到异常调控(61个上调蛋白；195个下调蛋白) (图3B)。两组细胞的重叠调控蛋白仅占鉴定到蛋白总数的~1%(图3C)。这提示，SARS-CoV-2感染对两类细胞蛋白组的调控模式是不同的。

GO富集分析显示，在肺泡上皮细胞中，受到显著影响的生物学过程包括细胞周期、细胞增殖和细胞程序性死亡等(图3D)。而在肺微血管内皮细胞中，蛋白代谢过程、中性粒细胞介导的免疫和信号转导等生物过程均被显著影响(图3E)。值得注意的是，在病毒感染的肺泡上皮细胞中IL-1α和ISG15蛋白表达显著上调，这表明先天免疫通路在病毒感染肺泡上皮细胞后被激活。病毒感染对内皮细胞的影响可能是由感染肺泡上皮细胞分泌的细胞因子介导的。

图3. SARS-CoV-2感染对于肺泡上皮细胞和肺微血管内皮细胞影响

SARS-CoV-2感染导致肺泡上皮细胞线粒体损伤并引发氧化应激反应

通过亚细胞定位注释和PPI分析，研究人员发现感染组的肺泡上皮细胞中，定位于线粒体的差异表达蛋白最多，其中若干线粒体蛋白为呼吸链复合物成分（图4A）。线粒体是细胞内活性氧（ROS）的主要产生场所，线粒体功能障碍导致ROS产生增加，并引发氧化应激和细胞损伤。进一步检测发现，感染组肺泡上皮细胞的线粒体ROS水平显著升高，证实了感染导致细胞线粒体损伤（图4B）。同时，蛋白质组学分析显示，感染组的肺泡上皮细胞中8种氧化应激反应相关蛋白表达显著上调，IL1α为其中之一（图4C）。根据相关文献，过量ROS产生可上调IL1α表达^2,3。因此，研究人员提出了一个假设，SARS-CoV-2感染肺泡上皮细胞引发线粒体损伤并导致ROS过量产生。过量的ROS刺激IL1α释放，并进一步诱导相邻肺微血管内皮细胞的免疫反应。

图4. SARS-CoV-2感染导致肺泡上皮细胞线粒体损伤并引发氧化应激反应

自噬通路抑制剂Daurisoline显著抑制SARS-CoV-2感染

通过透射电镜检测，研究人员发现，SARS-CoV-2主要感染肺泡上皮细胞，并在细胞内大量复制（图5A, B），而在肺微血管内皮细胞中，未发现有病毒复制的现象（图5C, D）值得注意的是，在感染的肺泡上皮细胞中，研究人员发现有大量自噬小体（AV）存在。蛋白组学分析发现病毒感染导致肺泡上皮细胞大量自噬通路蛋白表达异常（图5E）。因此推测，SARS-CoV-2有可能通过挟持宿主细胞的自噬通路完成其自身复制。

为了验证这个猜想，研究人员利用Vero E6细胞进行抗病毒药物筛选，测试自噬通路抑制剂是否对SARS-CoV-2感染有抑制效果。筛选结果发现，Daurisoline（蝙蝠葛苏林碱，一种自噬抑制剂）能显著抑制SARS-CoV-2在Vero E6细胞中的复制（图5F）。同时，在肺泡上皮细胞中（HPAEpiC）进行了进一步验证，Daurisoline同样显示出很好的抗SARS-CoV-2感染效果。

图5. SARS-CoV-2感染导致肺泡上皮细胞自噬通路异常调控

总的来说，该研究运用全新一代4D定量蛋白组学方法，探究SARS-CoV-2感染肺泡过程中，病毒对于肺泡上皮和肺微血管内皮的损伤机制。研究揭示，SARS-CoV-2主要攻击、感染肺泡上皮细胞，并通过释放细胞因子方式间接介导肺微血管内皮细胞损伤，细胞自噬通路在病毒感染宿主细胞过程中受到异常调控。通过Daurisoline特异性抑制细胞自噬通路可以显著抑制SARS-CoV-2复制，证明该药物具有明显的抗SARS-CoV-2感染效力。这些发现将提高对COVID-19发病机理的理解，同时对于靶向药物的开发提供一些指导和帮助。

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参考文献

1. Meier, F. et al., 2018, Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer. Mol Cell Proteomics.

2. Mitsopoulos, et al., 2010, Cytotoxicity and gene array analysis of alveolar epithelial A549 cells exposed to paraquat. Chem Biol Interact.

3. Tanaka, Y., et al., 2018, Tryptophan Photoproduct FICZ Upregulates IL1A, IL1B, and IL6 Expression via Oxidative Stress in Keratinocytes. Oxid Med Cell Longev.

4. Peng Wang, et al., 2020, A cross-talk between epithelium and endothelium mediates human alveolar–capillary injury during SARS-CoV-2 infection. Cell Death & Disease.

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