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一作精读 | 看四川华西医院课题组如何运用蛋白质组学+转录组学发一区顶刊？

鹿明生物

2022.1.18

● 前言

2021年10月四川大学华西医院中西医结合科唐文富、万美华与移植免疫室刘敬平团队（一作华西医院中西医结合科胡倩）在Acta Pharmaceutica Sinica B发表的题为“Emodin attenuates severe acute pancreatitis-associated acute lung injury by suppressing pancreatic exosome-mediated alveolar macrophage activation”的研究成果，通过蛋白质组学+转录组学研究方法，发现大黄素引发外泌体通过抑制代谢通路来减少肺泡巨噬细胞的活化和改善肺部炎症的特征，探究了外泌体在参与炎症相关器官损伤中的重要作用，为大黄素可以通过减少胰腺外泌体介导的肺泡巨噬细胞活化来减轻严重急性胰腺炎相关的急性肺损伤提供依据。

中文标题：大黄素通过抑制胰腺外泌体介导的肺泡巨噬细胞活化减轻严重急性胰腺炎相关的急性肺损伤

研究对象：大鼠血浆外泌体

发表期刊：Acta Pharmaceutica Sinica B

影响因子：11.413

发表时间：2021年10月

合作单位：四川大学华西医院

运用生物技术：TMT标记定量蛋白组学（由欧易/鹿明生物提供技术支持）、转录组学

● 研究背景

急性胰腺炎是一种胰腺炎性疾病，大约20%–30%的急性胰腺炎患者会进展为严重急性胰腺炎(SAP)，但严重急性胰腺炎相关的急性肺损伤（SAP-ALI）发展的潜在机制仍然不清楚，并且仍然缺乏减轻SAP-ALI的有效干预措施。因此，探索SAP-ALI发展的潜在机制，并研究可能对这种情况有效的治疗药物非常重要。

在临床上，大黄素已经报道通过调制肺部炎性微环境以减轻SAP和SAP-ALI。在这项研究中，我们假设大黄素可能通过调节胰腺外泌体诱导的肺部炎症来减轻SAP-ALI。为了研究这一假设，我们建立了SAP-ALI大鼠模型，并评估了大黄素治疗后肺部炎症、血浆外泌体内含物以及巨噬细胞表型等变化。在体外和体内评估了大黄素干预的SAP大鼠血浆外泌体对肺泡巨噬细胞表型的影响。使用蛋白质组学分析、RNAseq和网络药理学分析了外泌体的内容物和大黄素通过调节血浆外泌体进而减轻重症急性胰腺炎相关肺损伤的可能机制。

● 研究思路

● 研究结果

1. 大黄素对SAP-ALI有治疗作用

实验中选择了10 mg/kg的大黄素。（图1）A-C中，大黄素治疗显著降低SAP大鼠淀粉酶、脂肪酶、胰腺和肺组织病理损伤（P<0.0001）。SAP组大鼠肺组织表现出高水平的CD68+巨噬细胞和促炎因子（MPO 和TNF-α)的浸润，而大黄素治疗后，肺组织中这些炎症标志物的水平显着降低（图 1D-J）。

图1 | 大黄素对 SAP-ALI 有治疗作用

(A) 假手术组(sham)、SAP模型组(SAP)、SAP加大黄素治疗组(Emo)血清淀粉酶和脂肪酶水平

(B) 使用 H&E 染色（比例尺=50 μm）和胰腺组织病理学评分对胰腺进行形态学观察

(D) 大鼠肺组织中的 MPO 水平 (n= 6)

(E) 使用免疫组织化学评估的大鼠肺组织中的 CD68 表达

(F) 肺组织中 CD68 表达的量化 (n= 6)

(G) 使用免疫组织化学评估的大鼠肺组织中的TNF-α表达

(H) TNF-的定量α在肺组织中的表达 (n= 6)

(I) 通过 ELISA 在大鼠肺组织中评估的TNF-α水平

2.SAP-ALI中血浆外泌体的表征

透射电子显微镜（TEM）和纳米粒子追踪分析（NTA）显示三组中的血浆外泌体呈电镜杯状结构，大小为60-120 nm（图2A和B）。大黄素处理组的外泌体平均大小略有增加（~86 nm），但各组之间没有显著差异（P> 0.05）（图2C）。SAP大鼠血浆中外泌体数量较多，大黄素治疗后血浆外泌体数量显著减少（P< 0.01，图2D)。三组大鼠血浆外泌体均表达外泌体阳性标志物（TSG101和CD63），但不表达阴性标志物（Calnexin，图2E）。并且相比sham组，SAP大鼠血浆外泌体中TSG101和CD63的水平增加，但大黄素抑制这两个指标的蛋白水平（图2E和F）。

图2 | SAP-ALI 中血浆外泌体的表征

(A) 每组大鼠血浆外泌体的代表性 TEM 图像，比例尺 = 100 nm

(B) NTA 检测到的每组血浆外泌体的大小分布

(D) 血浆外泌体浓度 (n= 3)

(E) 血浆外泌体中 TSG101、CD63 和 Calnexin 水平的蛋白质印迹分析。GAPDH 作为对照。

(F) 血浆外泌体中 TSG101 和 CD63 表达的定量分析 (n= 3)

3.大黄素在体内改善SAP外泌体诱导的肺部炎症

为了研究大黄素对体内循环外泌体摄取的影响，从不同组大鼠中分离出的血浆外泌体用DIR染料标记，然后尾静脉注射到健康大鼠体内。如图3所示A，输注的血浆外泌体主要被肝、肺、脾和肾吸收。SAP大鼠的外泌体（SAP-exos；sham-exos和emo-exos分别表示来自假手术组和大黄素治疗组大鼠血浆外泌体）在肝脏、脾脏、肺和胰腺中的聚集明显多于sham-exos和emo-exos；这些外泌体不在心脏和小肠表达。H&E染色显示肺是外泌体干预后最严重的器官损伤（图 3C）。进一步肺组织切片中观察到DIR标记的血浆外泌体靶向CD68+巨噬细胞（图3B）。

与给予sham-exos的大鼠相比，给予SAP-exos的大鼠肺组织病理评分和MPO的水平显著增加，而相比SAP-exos治疗的大鼠，给予emo-exos的大鼠肺炎症严重程度明显降低（图3C和D），并且emo-exos组大鼠M1型巨噬细胞和促炎因子水平均明显降低，抗炎型（M2）型巨噬细胞和抗炎因子（IL-10）水平明显高于SAP-exos组（P< 0.05 和P< 0.001，分别为图3E-G）。

图3 | 大黄素在体内改善 SAP 外泌体诱导的肺部炎症

(A) 三组（sham-exos、SAP-exos和Emo-exos）的外泌体在体外用DIR标记，并在健康大鼠尾静脉注射DIR标记的外泌体后24小时获得离体器官的荧光图像

(B) 三组肺组织切片的代表性荧光图像。CD68 被 CY5 标记，发出粉红色荧光，外泌体发出红色荧光，比例尺 = 50 μm

(D) 大鼠肺组织中 MPO 的表达 (n= 6）

(E、F) 尾静脉注射外泌体后 24 小时，收集 BALF 并使用流式细胞术分析巨噬细胞标记物 CD68、M1型巨噬细胞标记物 CD86 和 M2 型巨噬细胞标记物 CD163 的表达

(P) ELISA 检测的 BALF 中促炎因子 NO、TNF-α、MIP-2 和抗炎因子 IL-10 的水平 (n= 6)

4.大黄素在体外抑制SAP外泌体诱导的肺泡巨噬细胞活化

如图4A所示，不同组大鼠的血浆外泌体在体外被肺泡巨噬细胞吸收。与sham-exos组相比，SAP-exos组的肺泡巨噬细胞表达了更高水平的M1型巨噬细胞标记CD68+CD86+(P< 0.0001)，而暴露于emo-exos的巨噬细胞表达了更低水平的M1型巨噬细胞标记物CD68+CD86+(P< 0.0001)，更高水平的 M2型巨噬细胞标记CD68+CD163+（分别为P< 0.01、P< 0.001，图4B和C）。与暴露于sham-exos的肺泡巨噬细胞相比，SAP-exos干预的细胞培养基中的IL-10水平明显降低，而emo-exos则增高了培养基中的IL-10水平（P< 0.001 )（图4D）。如图4E-K所示，SAP-exos组的条件培养基诱导健康大鼠肺泡壁增厚和中性粒细胞浸润，并增加肺组织中MPO、CD68和TNF-α的表达水平（P< 0.0001），而emo-exos组的条件培养基处理导致肺组织病理评分和MPO、CD68和TNF-α水平明显低于SAP-exos组（P< 0.001，P< 0.0001）。

图4 | 大黄素在体外抑制 SAP 外泌体诱导的肺泡巨噬细胞活化

(A) 血浆外泌体用 DIR 标记并在体外与原代肺泡巨噬细胞孵育24 小时。共聚焦显微镜获得的代表性图像

(B) 与外泌体一起孵育的巨噬细胞 (CD68+)中 M1 (CD86+) 和 M2 (CD163+) 标记物的流式细胞术分析

(D) ELISA检测培养基中促炎因子NO、TNF-α、MIP-2和抗炎因子IL-10的水平(n= 6）

(E) 用巨噬细胞条件培养基 (CM) 处理后健康大鼠肺组织的形态学观察，比例尺 = 50 μm

(F) 对应图 E (n= 6) 的肺组织病理学评分

(G) MPO 在大鼠肺组织中的表达 (n= 6)

(H) 免疫组化检测大鼠肺组织 CD68 表达，比例尺 = 50 μm

(I) 肺组织中 CD68 表达的定量结果 (n= 6)

(J) 免疫组织化学检测大鼠肺组织中TNF-α 的表达，比例尺 = 50 μm

(K) 肺组织中 TNF-α表达的定量结果(n= 6）

5.大黄素抑制 SAP 期间胰腺外泌体的分泌

为了探索SAP条件下大黄素对胰腺外泌体产生的影响，分离并分析了胰腺组织和腺泡细胞分泌的外泌体。胰腺组织分泌的外泌体呈现出特征性杯状结构，大小为50-100 nm（图 5A和 B）。与血浆外泌体的变化一致，与假手术组相比，SAP大鼠胰腺外泌体（SPE，相应的NPE和EPE分别表示假手术大鼠和大黄素治疗的SAP大鼠胰腺外泌体）的分泌显著增加（P< 0.001)，而大黄素治疗减少了SAP大鼠胰腺外泌体的分泌（图5C、P< 0.0001)。三组大鼠的胰腺外泌体均表达外泌体阳性标记TSG101和CD63，但不表达阴性标记Calnexin（图5D）。腺泡细胞分泌的外泌体也呈现杯状结构，大小为50-100 nm，并表达TSG101和CD63，不表达Calnexin（图5F-J）。虽然牛磺胆酸钠刺激略微升高了胰腺腺泡细胞外泌体的分泌（P>0.05)，但是大黄素显著抑制了牛磺胆酸钠刺激的腺泡细胞外泌体的分泌（图5H，P< 0.0001）。

图5|大黄素抑制 SAP 期间胰腺外泌体的分泌

(A) 假手术组(NPE)、SAP 模型组 (SPE) 和大黄素治疗组(EPE)中胰腺外泌体的代表性TEM图像

(B) 每组胰腺外泌体的大小分布，比例尺 = 100 nm

(D) 胰腺外泌体中 TSG101、CD63 和 Calnexin 的蛋白质印迹分析。β-肌动蛋白用作上样对照，胰腺裂解物用作对照

(E) 胰腺外泌体中 CD63 和 TSG101 表达的定量分析 (n= 6）

(F) PBS处理的NACE组、MACE组（500 μmol/L牛磺胆酸钠处理1 h）和EACE组（20 μmol/L大黄素预处理30 min然后用 500 μmol/L 牛磺胆酸钠处理 1 小时）中腺泡细胞外泌体的代表性TEM图，比例尺 = 100 nm

(G) 每组腺泡细胞外泌体的大小分布

(H) 腺泡细胞中外泌体产生的定量分析 (n= 6)

(I) 腺泡细胞分泌的外泌体中 TSG101、CD63 和 Calnexin 的蛋白质印迹分析。β-肌动蛋白用作上样对照，腺泡细胞裂解物用作对照

(J) 腺泡细胞分泌的外泌体中 CD63 和 TSG101 表达的定量分析 (n= 6）

6.大黄素对血浆外泌体蛋白含量的影响

图6A中的热图显示了165个显著差异表达的蛋白质（|logFC| >0.58；SAP组与假手术组）。图6B中的火山图显示了外泌体中的前10种蛋白质（SAP组与sham group)，包括HACL1、FABP1、SLC27A2、LRRC59、AKR1C1、IDH1、PAH、LOC100909700、RT1-CE1和HIST3H2BA。对差异表达的蛋白质进行GO（生物学过程、细胞成分和分子功能）和KEGG通路富集分析以揭示其生物学功能（图6C和D）。SAP组中差异表达的外泌体蛋白参与多个过程，包括有机酸的降解、线粒体基质与有机酸的结合、碳代谢和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）信号（图6D)。PPARγ信号传导被认为是大黄素通过间接下游蛋白，如IDH1、FABP1、HMGCS2和SCP2E影响外泌体的主要途径，（图6E）。通过蛋白质印迹也验证了潜在的大黄素干预的下游蛋白表达的变化。例如，SAP大鼠胰腺组织、胰腺外泌体和血浆外泌体中的IDH1水平高于假手术大鼠，而大黄素治疗降低了SAP诱导的外泌体和胰腺组织中的IDH1水平（图6F和G)。

图6 | 大黄素对血浆外泌体蛋白含量的影响

(A) 假手术组和 SAP 组 (n= 3)中外泌体蛋白的热图分析

(B) 假手术组和 SAP 组外泌体差异表达蛋白质的火山图

(C、 D) 假手术组和 SAP 组之间差异表达的外泌体蛋白的 GO和 KEGG 通路分析

(E) 假手术组& SAP 组血浆外泌体蛋白和大黄素靶基因的网络药理学分析

(F) 假手术组、SAP 组和大黄素组的胰腺组织、胰腺外泌体和血浆外泌体中 IDH1 的蛋白质印迹分析

(G) IDH1 表达的定量分析 (n= 3)

7.大黄素对巨噬细胞和肺组织PP-ARγ-NF-κB通路的影响

与sham-exos相比，SAP-exos减少肺泡巨噬细胞PPARγ的蛋白水平和增加PPARγ的和p-NF-κB的表达，而与SAP-exos组相比，大黄素-exos(emo-exos)干预的肺泡巨噬细胞和肺组织PPARγ蛋白水平明显增高，而p-PPARγ和p-NF-κB水平降低低（图7A、B、D和E）。SAP-exos处理的巨噬细胞表现高水平促炎因子（NO、TNF-α和MIP-2）的表达，而这些促炎因子在sham-exos组和emo-exos组巨噬细胞中明显降低（图7）C）。PPARγ的激活剂罗格列酮对肺泡巨噬细胞和肺组织中的促炎因子表达没有影响，而PPARγ的拮抗剂GW9662则增加肺泡巨噬细胞和大鼠肺组织中NO、TNF-α和MIP-2的表达水平（图7C和F）。

图7 | 大黄素对肺泡巨噬细胞和肺组织PPARγ- NF-κB 通路的影响

（A）暴露于sham-exos（假手术组大鼠血浆外泌体）, SAP-exos（SAP大鼠血浆外泌体）和Emo-exos（大黄素治疗的SAP大鼠血浆外泌体）PPARγ激动剂罗格列酮和拮抗剂 GW9662的肺泡巨噬细胞p-PPARγ，NF-κB，p- NF-κB的蛋白印迹分析图。GAPDH 用作上样对照

（B）肺泡巨噬细胞 (n= 3)中 p-PPARγ、PPARγ、NF-κB和 p-NF-κB 表达的定量分析

（C）ELISA 检测细胞培养基中促炎因子 NO、TNF-α和 MIP-2 的水平（n= 3）

（D）暴露于sham-exos（假手术组大鼠血浆外泌体）, SAP-exos（SAP大鼠血浆外泌体）和Emo-exos（大黄素治疗的SAP大鼠血浆外泌体）PPARγ激动剂罗格列酮和拮抗剂 GW9662的健康大鼠肺组织p-PPARγ，NF-κB，p- NF-κB的蛋白印迹分析图。GAPDH 用作上样对照

（E）肺组织中 p-PPARγ、PPARγ、NF-κB和 p-NF-κB 表达的定量分析(n= 3)

（F）ELISA检测肺组织中促炎因子 NO、TNF-α和 MIP-2 的水平（n= 3）

8.大黄素引发的外泌体对肺泡巨噬细胞和 SAP-ALI 大鼠的影响

继续分析大黄素治疗相关的外泌体对肺泡巨噬细胞极化状态和SAP-ALI大鼠肺组织促炎或抗炎因子的变化。如图8A和B，与NaTC（牛磺胆酸钠刺激）组肺泡巨噬细胞上清液相比，NaTC+大黄素组上清液显着降低M1型肺泡巨噬细胞（CD68+CD86+）的比例和促炎因子（NO、TNF-α和 MIP-2)的水平，并增加抗炎因子(IL-10)的表达（P< 0.001，图 8C）。为了在体内验证大黄素治疗相关的外泌体对SAP-ALI大鼠肺组织中的治疗作用，将三组血浆外泌体（sham-exos、SAP-exos和Emo-exos）通过尾静脉注射到SAP-ALI大鼠体内。如图所示图8D和E，三组外泌体不影响SAP-ALI大鼠肺组织p-PPARγ的表达。相比sham-exos，SAP-exos降低了SAP-ALI大鼠肺组织PPARγ的表达和升高了NF-κB的表达，而相比SAP-exos，emo-exos则升高PPARγ的表达和降低NF-κB的蛋白水平。并且SAP-exos造成SAP-ALI高水平的促炎因子环境（高NO、TNF-α、 MIP-2和低IL-10），而与SAP-exos组相比，emo-exos 显著降低了这些促炎因子水平并增加了SAP-ALI大鼠肺组织中IL-10 的表达（图8F）。

图8 | 大黄素引发的外泌体对肺泡巨噬细胞和 SAP-ALI 大鼠的影响

(A) 原代大鼠肺泡巨噬细胞 (CD68+)中 M1 型(CD86+) 和 M2型 (CD163+) 标记物的流式细胞术分析。NaTC：牛磺胆酸钠刺激1 小时；NaTC+Emo：20 μmol/L 大黄素预处理 30 分钟+牛磺胆酸钠刺激1 小时；NaTC+Emo+GW4869: 20 μmol/L 大黄素预和10 μmol/L GW4869预处理 30 分钟+牛磺胆酸钠刺激1 小时。

(B) 图A流式细胞术的定量结果

(D) 来自假大鼠、SAP 大鼠和大黄素处理的 SAP 大鼠的血浆外泌体（sham-exos、SAP-exos、Emo-exos）尾静脉干预SAP-ALI大鼠肺组织p-PPARγ、PPARγ、p-NF-κB 和 NF-κB 的蛋白质印迹分析

(E) SAP-ALI大鼠肺组织中 p-PPARγ、PPARγ、p-NF-κB 和 NF-κB表达的定量分析(n= 3)

(F) ELISA 检测肺组织中促炎 (NO, TNF-α, MIP-2) 和抗炎 (IL-10) 因子的水平 (n= 3)

● 研究结论

证明了大黄素可以改善大鼠的SAP-ALI，这种效果至少部分依赖于外泌体机制。大黄素减少SAP的条件下有害胰源性外泌体的生产、抑制外泌体介导的肺泡巨噬细胞的M1极化和促炎因子释放，其作用部分通过调节血浆外泌体PPAR信号通路蛋白。这项研究表明，阻断胰腺外泌体介导的肺泡巨噬细胞活化可能是缓解SAP-ALI的一种有前景的策略，并揭示了外泌体在参与炎症相关器官损伤中的重要作用。

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在临床上已经报道大黄素通过改善肺部炎性微环境以减轻SAP和SAP-ALI。在这项研究中，通过建立了SAP-ALI大鼠模型，运用蛋白组学+转录组学研究评估了大黄素治疗后肺部炎症、血浆外泌体内容物以及巨噬细胞表型变化。在体外和体内评估了大黄素干预后的SAP大鼠血浆外泌体对肺泡巨噬细胞表型的影响。本文探索SAP-ALI发展的潜在机制并研究阻断胰源性外泌体介导的肺泡巨噬细胞活化作用，为缓解SAP-ALI提供可能。

文末看点 | lumingbio

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