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各种修饰型寡核酸的LC/MS分析
反义核酸等为代表的核酸药物，不仅可以用于先天性基因疾病和代谢异常的治疗，还具有作为抗癌药物及疫苗使用的广泛应用前景。到目前为止，被批准的核酸药物主要是20mer左右的碱基配对低聚核酸（DNA,RNA），其中大部分都进行了化学修饰。用S（硫原子）取代O（氧原子）的磷酸化寡核酸（见图1）比未修饰的寡核酸在体内更不易被分解，稳定性更高。此外，除了磷酸部修饰，还有糖部被修饰的应用（见图2），位于序列两个末端的数个碱基上导入了2''MOE（2''-Methoxyethyl）修饰的寡核酸已经在上市的核酸药物中被采用。
核酸药物的开发和品质管理需要高灵敏度、高选择性的分析方法，其中之一就是LC/MS的检测。在寡核酸的分析中经常使用离子对反相模式，但是离子对试剂容易残留在设备中，从而造成灵敏度降低的问题。另外，在离子交换模式中，流动相必须使用高浓度的盐，不适合LC/MS的测试。
本研究使用的Shodex HILICpak VN-50色谱柱是新开发的高性能HILIC（亲水性相互作用色谱）色谱柱。填料使用多孔性聚乙烯醇微粒键合二元醇基，非常适合LC/MS的分析。如下介绍VN-50 2D色谱柱（内径2.0mm），不使用离子对试剂，使用较低浓度的挥发性盐溶液和乙腈混合溶液作为流动相，分析化学修饰后的寡核酸等的应用实例。此外，还将介绍使用内径1.0mm的VN-50 1D（特别定制）色谱柱进行高灵敏度分析的应用实例。
图1.核酸的磷酸部修饰
图2.核酸的糖部修饰
LC/MS仪器使用Shimadzu Nexera/LCMS-8030 Plus，色谱柱使用Shodex HILICpak VN-50 2D（2.0mm I.D.×150mm，柱管材质：PEEK）以及VN-50 1D（1.0mm I.D.×150mm，柱管材质：SUS内PEEK）。填料粒径5μm，孔径100Å。流动相是(A)甲酸铵水溶液和(B)乙腈高压混合的溶液，混合比例做了各种探讨。色谱柱温度40℃，检测器使用UV(260nm）后接MS，MS的离子化法使用ESI，检测模式SIM（-）。
1.各种寡核酸的分析
确认了磷酸化寡核酸和未修饰的寡核酸的洗脱差异。将合成寡DNA20mer（样品1），合成磷酸化硫代寡DNA20mer（样品2），合成寡RNA20mer（样品3），合成磷酸化硫代RNA20mer（样品4）分别用超纯水溶解配成0.1mg/mL溶液使用。
2.糖部修饰型寡RNA的分析
确认了2''位修饰的寡RNA和未修饰的寡RNA的洗脱差异。核酸糖部全被2''MOE修饰的磷酸化硫代寡RNA20mer（样品5），两末端5碱基被2''MOE修饰的磷酸化硫代寡RNA20mer（样品6），核酸糖部全部被2''-OMe（2''-O-Methyl）修饰的磷酸化硫代RNA20mer（样品7），分别用超纯水溶解成0.2mg/mL的溶液使用。
3.VN-50 1D和VN-50 2D的灵敏度比较
为了提高LC/MS的灵敏度，分别使用内径1.0mm的VN-50 1D色谱柱和内径2.0mm的VN-50 2D色谱柱进行了分析比较。将样品6使用超纯水溶解成0.2mg/mL的溶液使用。
4.寡DNA 10~50mer的分析
进行了~50mer的寡DNA分离确认。合成寡DNA10mer（样品8），合成寡DNA20mer（样品9），合成寡DNA30mer（样品10），合成寡DNA40mer（样品11），合成寡DNA50mer（样品12），分别用超纯水溶解成0.02mg/mL的溶液备用。
所有本研究用的样品见下表。
表1.本研究使用的寡核酸
图3为乙腈初始比例64%，分析开始10分钟后直线下降至56%，保持10分钟的梯度条件分析20mer的各种寡核酸及磷酸化硫代型寡核酸的LC/UV/MS结果。
样品亲水性越高在HILIC模式下保留越强，合成寡DNA的疏水性比合成寡RNA高，所以在HILIC模式保留较弱（参考峰1,3）。另外，磷酸化硫代寡核酸的磷酸部全部S化，使得疏水性提高，因此其保留能力比非磷酸化硫代寡核酸弱（参考峰1,2和峰3,4）。
图3.各种寡核酸的UV/MS谱图
图4为乙腈初始比例64%，分析开始10分钟后直线下降至57%并保持10分钟的提多模式分析20mer的各种修饰型寡RNA和未修饰型寡RNA的LC/UV/MS结果。合成磷酸化寡RNA导入2''MOE基团后疏水性提高，和未经修饰的寡RNA相比，保留变弱（参考峰1,2,4）。另一方面，2''-OMe的疏水性没有2''-MOE那么高，即使修饰了所有糖部，保留也不会很弱，和2''-MOE部分修饰的样品洗脱位置大致相同（参考峰2,3）。
图4.糖部修饰型寡核酸的UV/MS谱图
图5是使用内径1.0mm（VN-50 1D）和2.0mm(VN-50 2D)色谱柱分析样品6的结果比较。使用乙腈初始比例设置为64%，分析开始10分钟后直线下降至57%并保持10分钟的梯度条件进行分析。分析时间大致相同，内径1.0mm的色谱柱流速低可以提高LC/MS的灵敏度。
图5.糖部修饰型寡核酸的MS谱图
图6是使用乙腈初始比例65%，分析开始10分钟后直线下降为45%并保持10分钟的梯度条件分析，10mer、20mer、30mer、40mer、50mer的寡DNA的分析结果如下。通过提高流动相中甲酸铵溶液比例的梯度条件，长链寡核酸的分离效果得到提升。
图6.寡核酸10-50mer的UV谱图
实验证明，使用聚合物基质HILIC色谱柱Shodex HILICpak VN-50系列色谱柱可以对核酸药物中磷酸部修饰及糖部修饰的各种修饰型寡核酸进行LC/UV/MS分析。
流动相使用50mM甲酸铵水溶液和乙腈的混合溶液，主要通过HILIC模式进行分离。因此不需要像反相模式一样添加离子对试剂和高浓度盐，从而减少LC/MS设备维护工序，在纯化流程中也可以简化脱盐工序。另外，聚合物基质的填料有良好的耐碱性，可以使用碱液清洗再生，对消除精密分析/制备中的非特异性吸附问题也有贡献。此外，内径1.0mm的VN-50 1D色谱柱通过降低流速可以提高灵敏度。
Shodex HILICpak VN-50系列色谱柱在核酸药物的开发，品质管理，纯化领域都非常适用。
