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IF 28 | 罕见细胞类型一网打尽，单细胞结合空间转录组揭示骨髓的分子、细胞和空间特征

吉凯基因

2022.5.25

骨髓（BM）构成了终身造血和骨骼再生的主要场所。然而，它的细胞组成和不同 "壁龛 "的空间组织仍有争议。Baccin等人结合单细胞和空间分辨率的转录组学，系统地绘制了骨内膜、窦道和动脉血管龛的分子和细胞组成。

通过scRNAseq鉴定和表征BM常驻细胞类型

作者对来自小鼠骨髓 (bone marrow, BM) 的细胞进行了基于液滴的scRNAseq，然后从未消化的BM或酶解的骨骼中逐步耗尽高度丰富的细胞类型或富集罕见的细胞群(图1a)。总共包括了7497个细胞，形成了32个簇，对应于不同的细胞类型或分化阶段(图1b)。

BM的scRNAseq首先鉴定了主要的造血细胞类型，包括树突细胞、中性粒细胞、单核细胞、T细胞和不同发育阶段的B细胞(图1b)。这些主要免疫群体衰竭后，scRNAseq主要产生红系祖细胞，此外还确定了几种罕见细胞，神经许旺细胞(Mog，Mag)、平滑肌细胞(Tagln，Acta2)、推定成肌纤维细胞、九种不同的Pdgfra阳性间充质群体和两个内皮细胞(EC)簇。

为覆盖造血干细胞和祖细胞(HSPC)群体。对Lin-cKit+细胞进行了scRNAseq，结果显示跨越巨核细胞-红细胞和淋巴-骨髓分支的分化连续性以及一个独立的嗜酸性粒细胞/嗜碱性粒细胞前体簇(图1b)

图1

内皮细胞群包括表达Sca1 (Ly6a)的arterial ECs和表达Emcn的sinusoidal ECs(图2a，b)。间充质谱系包含软骨细胞、成骨细胞和几种较少描述的细胞类型。除三个不着色的成纤维细胞样群体外，作者发现了两个细胞群，与之前描述过的SCF-GFP+，Cxcl12–GFP+，Cxcl12-CAR细胞具有相似的转录特性。但后两个群体不同程度地表达脂肪细胞 (adipocyte) 和骨谱系 (osteo-lineage) 基因(图2d)，分别称为“Adipo-CAR”和“Osteo-CAR”细胞。Adipo-CAR表达高水平瘦素受体(Lepr)，与Lepr–Cre转录组高度相似性(图2c，d)；Osteo-CAR细胞表达更高的骨线(Sp7图2d)和较低的Lepr水平。此外，Ng2-和nestin-的间充质细胞，与之前描述的Ng2+Nestin+ MSCs相似，因此被命名为“Ng2+ MSCs”(图2a，c)。RNA-velocity 的伪时间分析表明Ng2+ MSCs置于分化的顶端。

为评估细胞分离策略对细胞类型恢复的影响，作者比较了整块骨头比较了冲洗BM和粉碎全骨释放骨髓的方法，并评估了酶解的影响。结果表明，冲洗和压碎的BM中均发现了大多数细胞群，但许多细胞群仅在强烈的物理处理或酶消化后有效释放(图2f)。与冲洗骨相比，成纤维细胞群、肌成纤维细胞和雪旺氏细胞在碎骨中更丰富。

图2

单细胞结合空间转录组学决定BM常驻细胞类型的空间分配

为了结合细胞的空间分布信息，作者开发了LCM-seq，从单细胞层中含有200–300个细胞的固定BM切片的LCM解剖区域生成了全长、高质量的转录组数据。根据窦道和动脉血管的存在与否，或根据与骨内膜的距离，对收集自骨髓中部的78个显微解剖区域应用LCM-seq，以描述骨内膜、骨外膜下、动脉血管、窦道和非血管龛的组成(图3a)。

为评估该种方法，作者选择了已知对相应生态位特异的细胞类型的标记基因，比较了它们在scRNAseq和相应的空间转录组学数据中的表达(图3b)。结果表明，成骨细胞基因在骨内膜处选择性富集，窦内皮细胞特异性基因在窦高丰度区域富集，动脉内皮基因在动脉富集。造血细胞群、雪旺氏细胞和肌成纤维细胞的标记基因集与任何确定的生态位均无显著相关性，表明这些细胞类型要么相对均匀地分布在生态位(造血细胞群)中，要么在LCM-seq数据中覆盖不足(雪旺氏细胞和肌成纤维细胞；图3c)。相反，其余12个群体的标记基因表达在不同生态位之间有显著差异(图3c)。

为评估BM细胞类型对候选龛位的优先定位，使用CIBERSORT算法计算估计了空间分辨率转录组学数据中scRNAseq定义的细胞群的频率(图3d-f)。结果表明，成骨细胞和软骨细胞仅在骨端龛位(图3e，f)；一种特异性成纤维细胞群优先定位于骨内膜，初步命名为“骨内膜成纤维细胞”；动脉ECs、平滑肌细胞和独特的成纤维细胞群特异性定位于小动脉龛位(图3e，f)，命名为“小动脉成纤维细胞”；sinusoidal龛影中发现了sinusoidal ECs，也存在于(亚)骨内膜龛影中(图2b)；Adipo-CAR细胞主要出现在高sinusoidal发生率区域，Osteo-CAR细胞优先局部化至小动脉或非血管龛位；Ng2+ MSCs不能被一致分配到一个生态位，可能是由于该人群中的额外异质性。

图3

细胞类型定位验证

为确认LCM-seq鉴定的BM细胞类型的空间关系，作者确定了个体人群特有的标记物组合，并对骨切片进行了免疫荧光成像。基因表达分析表明，Alpl和Cxcl12可区分Osteo-CAR (Cxcl12+Alpl+), Adipo-CAR(Cxcl12+Alpl-)和Cxcl12-Alpl+细胞类型，如成骨细胞，Ng2+ MSCs和动脉ECs(图4a)。为确认Adipo-和Osteo-CAR细胞的原位定位，作者对Cxcl12-GFP小鼠的长骨进行了全支架免疫荧光成像。中央BM的Cxcl12+Alpl-Adipo-CAR细胞主要位于鞘状窦中，与LCM-seq的结果一致(图4a)。Cxcl12+Alpl+Osteo-CAR细胞表现为非sinusoidal定位和高度网状形态(图4a-e)。Sca1+GFPdim小动脉的紧邻区域也经常观察到Cxcl12+Alpl+Sca1low Osteo-CAR细胞，Osteo-CAR的GFP high覆盖小动脉血管(图4f)。

图4

作者使用CD31、SM22、Pdpn、Pdgfr、Col1a1和Sca1作为标志物，特异性识别和定位平滑肌细胞(SM22+Pdpn-)、成纤维细胞群(Pdpn+Pdfgr+)、成骨细胞(Pdpn-col1a1+)和动脉内皮细胞(Pdpn-CD31+SCA1+，图5)。LCM-seq表明，表达CD31/Sca1的动脉被SM22+Pdpn-平滑肌细胞和Pdpn+成纤维细胞包裹(图5a)。免疫荧光证实存在Pdpn+col1a low成纤维细胞，定位于由Pdpn-col1a high成骨细胞组成的骨内膜的骨面侧(图5b)。皮质骨和骨膜区域也发现了Pdpn+细胞，因此类似于中央骨髓中的成纤维细胞样细胞也可能来源于BM远端区域(即皮质骨、骨骺或骨膜；图5c)。

图5

基于scRNAseq数据，可准确预测BM常驻细胞类型的空间关系

作者开发了RNA-Magnet算法，研究是否可以通过细胞粘附分子的差异表达来预测BM群体的细胞类型特异性定位。为评估改算法，作者引入了四个锚定群体:骨内膜生态位的成骨细胞，sinusoidal生态位的sinusoidal ECs，以及代表小动脉生态位的动脉ECs和平滑肌细胞(图6a)。

通过空间转录组学测量，预测BM群体对不同壁龛的粘附性与它们的差异化定位程度密切相关(图6b)。几乎所有细胞群的特异性定位也被高度准确地再现(图6c)。因此，RNA-Magnet能够根据单细胞基因表达数据预测空间定位，并强调了细胞粘附蛋白在BM组织中的重要性。

图6

BM中细胞因子和生长因子的细胞和空间来源

发生在骨髓中的关键生物过程被认为是由一系列不同的细胞因子和生长因子的协调作用所介导。然而，人们其来源仍然缺乏认知。单细胞数据表明，Cxcl12和Scf (Kitl) 由动脉内皮细胞和一些间质细胞类型表达，但在Adipo-和Osteo-CAR细胞群中高出几个数量级（图6a，也见图4）。FACS表明，Adipo-CAR表现为CD45^negCD71^negTer119^negCD41^negCD51⁺VCAM1⁺CD200^midCD61^low，而Osteo-CARs和NG2⁺ MSCs高表达CD200和CD61（图6c）。两种CAR细胞群都是Cxcl12蛋白的主要生产者，内皮细胞可产生但处在较低的水平（图6d）。CAR也是B细胞和髓系承诺所需的关键细胞因子的主要生产者之一，如Il7和Csf1 (图6a)。此外，CAR细胞群产生了数量最多的不同细胞因子和生长因子 (图6e,f)。空间转录组学显示，被调查的五个壁龛拥有独特的细胞因子和生长因子生产模式（图6g, h）。CAR细胞衍生的细胞因子主要产生于动脉和窦道壁龛，高于非血管壁龛比，与Osteo-和Adipo-CAR细胞优先定位在各自的内皮支架上一致（图6g）。因此，产生专业细胞因子的BM常驻细胞（如Adipo-和Osteo-CAR细胞）的特异性定位导致了独特壁龛的建立，动脉和窦道壁龛是生产造血干细胞维持和分化因子的关键场所。

图7

BM的细胞间信号相互作用分析

作者将RNA-Magnet应用于可溶性信号介质(例如细胞因子、生长因子等)及其受体，以获得潜在细胞间信号相互作用的系统级概述(图8a)。

从RNA-Magnet分析到了两个不相连的信号簇，由成熟的免疫或非造血细胞组成，表明免疫和非免疫细胞优先在各自的组内通信 (图8a)。淋巴和髓系祖细胞接受来自血管和特别是窦性龛影中产生的细胞因子的强输入(图8b，c)。总之，这些分析支持了一个概念，即独特的生物BM过程由来自不同局部生态位的特定组合信号输入介导，并提供了BM中信号相互作用的系统级视图。