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Chem. Sci（IF 9.969）：纳米DESI MSI空间代谢组学和免疫荧光成像揭示骨骼肌纤维类型的分子特征

鹿明生物

2023.6.02

研究背景

骨骼肌在人体中负责运动、保持姿势、维护代谢平衡和呼吸等重要功能。它通常由排列成马赛克图案的不同类型肌纤维组成。然而，使用传统的体积表征方法很难分离和研究单个肌纤维类型的分子特征。骨骼肌纤维的代谢分析通常借助液相色谱质谱（LC-MS）来检测富含特定纤维类型的组织提取物，但此方法无法提供特定纤维类型中分子空间分布的信息。质谱成像（MSI）是一种高效无标记技术，可以清晰呈现生物样本中的分子分布。

在2023年3月，普渡大学的Julia Laskin教授及其研究团队在Chemical Science杂志（IF 9.969）上发表了一项名为Multimodal high-resolution nano-DESI MSI and immunofluorescence imaging reveal molecular signatures of skeletal muscle fiber types 的研究成果。通过运用纳米DESI MSI空间代谢组学方法，研究人员发现，磷脂中含有高度不饱和的脂肪酸链，而糖酵解肌纤维中的磷脂则存在较为饱和的脂肪酸链。这一发现表明膜的流动性在影响骨骼肌纤维的代谢特征方面起着关键作用，为骨骼肌生理学研究提供了重要见解。

研究思路

研究方法

研究材料：小鼠腓肠肌组织（GAS，n=3）；

研究技术：免疫荧光染色技术（IF）；

纳米DESI MSI空间代谢组学技术（Nano-DESI MSI）；

研究结果

1. 免疫荧光染色与纳米DESI MSI组合技术在相邻的连续横截面上对小鼠腓肠肌组织进行多模态成像

文章通过结合免疫荧光染色技术和纳米DESI MSI空间代谢组学技术，对小鼠腓肠肌组织的连续横截面进行多模态成像，揭示了不同纤维类型的化学成分差异。图1展示了三组生物学重复实验中获得的免疫荧光和纳米DESI MSI成像结果。图1a和b分别展示了正离子模式和负离子模式的纳米DESI MSI数据以及相应的免疫荧光图像。

虽然在成像图里，中深部区域和组织外有明显的化学差异，但因为缺少解剖标志和纤维尺寸小，很难分辨单个纤维并进行高精度的图像配准。为解决这个问题，作者开发了一种先进的图像配准和分割方法（见图2），并报告了在三次生物重复实验中检测到的分子标记，并用MS / MS方法进行鉴定。依据这些标准，观察到正负电离模式共可检测到140种独特的代谢物。

图1 | 骨骼肌纤维的多模态成像

图2 | 骨骼肌纤维的基于纳米DESI

MSI分析的多模态工作流程

2. 通过对腓肠肌组织提取的阳离子模式下特征代谢物进行线性判别分析

图3展示了对肌肉纤维进行的线性判别分析（LDA）结果，将所有观察到的m/z特征分为两大组。对应于IIb型纤维的蓝色圆圈在LD1和LD2轴上与其余纤维明显分离。而I型（绿色圆圈）、IIa型（红色圆圈）和IIx型（黑色圆圈）之间显示出重叠区域，说明这些纤维的化学成分有较大重叠。此结果概述了所分析m/z特征的分布及与特定纤维类型的关联。通过高分辨率空间脂质组学实验，建立了区分肌纤维的几个标准。应用这些标准进行肌纤维区别后，严格对照比较并未发现其他纤维类型的独特标记物，这与前述LDA分析结果相符。

图3 | 在阳性模式下在腓肠肌组织中

提取的所有特征的LDA分析

3. 四种分布模式的代表性的离子图像

本文发现了具有不同空间模式的分子标记组，设置了较为宽松的标准。如图4a所示，作者发现四种主要分布模式的离子图像。RG模式相关于I型和IIa型纤维中的增强物种，其中，I型和IIa型的比例小于1.5；RGBK模式表示I型、IIa型和IIx型纤维中增强的分子，且其比例也小于1.5；BL模式与IIb型纤维增强分子有关。不符合这些标准的分子被归为均匀分布于组织中的“无模式”。图4b展示相关分析结果的直方图。为探究纤维间显著差异，采用火山图比较纳米DESI MSI实验中鉴定的代谢物的p值和变化倍数。这些分子具有良好一致性。相似分子的抑制或增强揭示了它们的丰度从高氧化纤维向高糖酵解纤维逐渐过渡（I型> IIa型> IIx型> IIb型）。

图4 |（a）在骨骼肌组织中观察到的

不同模式的代表性离子图像

（b）条形图，显示根据在空间分布中观察到的

不同模式对物种进行分类的情况

表1 | 用于对腓肠肌组织中观察到的

不同模式进行分类的条件

4. 腓肠肌组织中鉴定所有分子的热图

图5展示了各种纤维类型中物质丰度变化的热图，其中氧化代谢相关分子数量大于糖酵解代谢相关分子。氧化代谢标志物包括心磷脂（CL），单酰基甘油（MG），氧化脂质和脂肪酸（FA）、酰基肉碱和高度不饱和磷脂等，而糖酵解代谢标志物主要有饱和与单不饱和磷脂、肌肽、鹅肌肽及组氨酸相关化合物等。在所有重复实验中，这些物质的丰度总是从I型/IIa型纤维到IIx型，再到IIb型逐渐过渡；而图5的离子图像也证实了这一观察结果。这些发现表明，纤维类型的化学成分不会发生显著变化，而是经历相对较小的变化，尤其是在不同纤维类型共存的区域，如腓肠肌组织的深层区域。

图5 | 腓肠肌组织中鉴定的所有分子的热图

5. 腓肠肌组织中检测到的所有磷脂的酰基链组成

通过深入研究膜成分（如磷脂）的结构，揭示了氧化与糖酵解纤维中不同酰基链的组成。如图6所示，所有12C到24C的脂肪酸在磷脂中的分布。在91种磷脂中，52种在氧化纤维含量较高，16种在糖酵解纤维中增强，23种在组织中均匀分布。有趣的是，相较于糖酵解纤维中的磷脂，氧化代谢相关的磷脂中多不饱和脂肪酸（PUFA）含量较高，包括二十二碳六烯酸（DHA）、二十二碳五烯酸（DPA）、FA 22:4和花生四烯酸（AA）。这种酰基链组成的趋势表明，磷脂结构与纤维功能之间具有密切关系。

图6 | 在碳长度范围为12C至24C的腓肠肌组织中

检测到的所有磷脂的酰基链组成

研究结论

本研究展示了一种结合nano-DESI MSI空间代谢组学与免疫组织化学纤维分型的高分辨率分子成像技术，用于分析骨骼肌纤维的分子特征。研究表明，氧化纤维和糖酵解纤维间存在化学差异，其中IIb型肌纤维表现出独特的糖酵解分子特征，但IIx型纤维的氧化代谢特征与其他类型肌纤维有所不同。这些发现揭示了生化途径与肌纤维收缩特性之间的关联，为理解骨骼肌生理机制提供了重要见解。

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纳米DESI MSI空间代谢组学技术在肌肉纤维研究方面取得了重要进展。通过这一技术能深入了解肌肉纤维代谢差异及其功能，并准确识别氧化与糖酵解纤维。磷脂结构与纤维功能的紧密联系表明，纳米DESI MSI技术在生物医学成像领域具有巨大的发展潜力，有望揭示生物体代谢过程的更多信息。纳米DESI MSI技术无疑是科技前沿的一项重要突破，为肌肉纤维研究开辟了新的视角。

参考文献——DOI: 10.1039/D2SC06020E

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