分享至
项目文章 | 单细胞RNA测序揭示了高级别和转移性膀胱癌的细胞和分子特征
2023年5月11日，山西医科大学第一医院杨晓峰教授团队在Cellular Oncology(Dordrecht)发表题为“Single-cell RNA sequencing reveals the cellular and molecular characteristics of high-grade and metastatic bladder cancer”的文章，该研究揭示了高级别和转移性膀胱癌的细胞和分子相似性和差异性的新特征，为今后的治疗提供了潜在的治疗靶点。
期刊：Cellular Oncology(Dordrecht)
影响因子：7.051
发表年月：2023年5月11日
材料：3例患者的膀胱癌组织，每个患者分别取癌旁正常组织(PNT)、原发肿瘤组织(PT)和淋巴结转移组织(LNM)
方法：10x Genomics单细胞3端测序
根治性膀胱切除术和盆腔淋巴结清扫是高危非肌肉浸润性膀胱癌 (NMIBC)和肌肉浸润性非转移性膀胱癌 (MIBC)的主要治疗方法。然而，在手术过程中，医生通常无法确认是否存在转移性淋巴结。在做经尿道膀胱切除术(TURB)时，医生往往也无法区分非恶性组织和肿瘤相关组织的界限，容易留下一些肿瘤残留组织，导致复发的风险很高。因此，检测膀胱癌（BC）的遗传物质正日益成为了解BC形成机制、进化过程和寻找更多治疗方案的关键。二代测序为我们提供了大量的BC突变基因集。然而，在研究肿瘤细胞的完整性和准确性方面存在许多局限性，而单细胞测序在很大程度上弥补了这一缺陷。
Result1 scRNA-seq显示BC的全细胞图谱
对3例患者的9个样本进行单细胞测序，每个患者分别取癌旁正常组织(PNT)、原发肿瘤组织(PT)和淋巴结转移组织(LNM)，所有患者都进行了根治性膀胱切除术和盆腔淋巴结清扫。9个样本中的50,158个细胞降维并聚类为16个细胞群(图1A, B)。经marker基因鉴定分为6种细胞类型，包括B细胞(CD79A)， T细胞(CD3D/E/G)，内皮细胞(PECAM1)、上皮细胞(EPCAM)、成纤维细胞(COL1A1)和巨噬细胞(lyz)(图1C)。
图1
Result2 PT和LNM的恶性上皮细胞显示高水平的CNV
指定免疫细胞作为区分恶性和非恶性细胞的参考进行infer CNV分析，发现上皮细胞表现出高水平的拷贝数变异(CNV)，这些细胞主要存在于PT和LNM部位(cluster6、9、14)(图2)。因此PT和LNM的上皮细胞是主要的恶性细胞。
图2
Result3 PT和LNM恶性上皮细胞亚群及基因表达谱
对恶性上皮细胞做亚型分析（图3I-K）及拟时序分析，发现主要分为PT和LNM两组(图3A-C)，表明PT和LNM在早期具有相同的肿瘤细胞谱系，而在晚期进化成不同的肿瘤细胞表型。分化过程中基因表达被分为四个不同的模块，其功能和信号通路注释主要是与细胞增殖相关的错配修复系统和信号通路突变（图3F-H）。还发现与不同细胞类型相同，基因表达也具有特异性(图3L)，具有LNM特异性标记物(LMO3)的人比具有PT (SLITRK6)的人生存期短(图30,R)。
Result4 癌症相关成纤维细胞(CAF)是TME的主要细胞群
在肿瘤微环境(TME)中，成纤维细胞和免疫细胞是主要的细胞群(图3S-W)。CAF被认为是肿瘤转移和耐药的重要因素，在PNT和PT中均有丰富的CAF。作者将其细分为炎性CAF (iCAF)、Myo-CAF和肌成纤维细胞亚型(图3T)。通过分析iCAF和Myo-CAF的高表达基因，发现Myo-CAF的基因(WNT5A和ENPP2)和iCAF的基因(SFRP4)调控Wnt信号通路，这是大多数癌症中常见的信号通路(图3W)。NRG1在iCAF和Myo-CAF中均有高表达，它通过介导ERBB2/3信号通路促进肿瘤进展。ERBB2/3信号通路是BC中最常见的信号通路之一，尤其是在高级别BC中。
图3
Result5 肿瘤相关巨噬细胞(TAM)在TME中丰富
骨髓细胞/巨噬细胞的亚型细分为M1巨噬细胞(cluster6)、M2巨噬细胞(cluster1/2/4/7/8)和树突状细胞(DC) (cluster3 ~ 5)(图4A-E)。各组中M2巨噬细胞所占比例较大(图4D)。与M1巨噬细胞抑制细胞生长和促进细胞杀伤功能不同，M2巨噬细胞主要促进生长和组织修复，能促进肿瘤细胞的增殖，抑制TME中的免疫细胞。M2、DC高表达预后不良相关的基因。其中，在M2巨噬细胞中高表达的lyve1被证实通过调节CSF1（主要由CAF分泌）来促进肿瘤进程和治疗耐药。高表达IDO1的DC已被证明具有抑制免疫细胞的作用。免疫组化染色图像显示，lyve1和IDO1在PT中呈高阳性(图4G、J)，在TME中肿瘤细胞和靠近肿瘤的间质细胞中高表达(图3F、I)，提示iCAF和TAM可能与肿瘤细胞有密切的关系。
图4
Result6 抑制性免疫系统包括T调节细胞(Treg)、CD8 +耗竭T细胞(Tex)和CD8 +常驻记忆T细胞(Trm)
作者单独对T细胞做了亚型分析，分为CD4+T及CD8+T的多种亚型：CD4 +幼稚T细胞(CD4naive)、CD4 +辅助T细胞(Th)、CD4 +调节性T细胞(Treg)和CD4 +细胞毒性T细胞(CD4cyto)、CD8 +记忆T细胞(Tm)、CD8 +耗竭T细胞(Tex)、CD8 +幼稚T细胞(CD8naive)、CD8 +细胞毒性T细胞(CD8cyto)和CD8 +常驻记忆T细胞(Trm)。
CD4+T
Treg主要存在于PT和LNM中(图H)；在PNT和PT中CD4cyto有两个高表达cluster(图F):cluster6和一小部分cluster3，其中含有CD4naive或Th，这部分在PT中高表达，作者推测CD4cyto可能在PT中分化为一种新的无细胞毒性表型，其功能与CD4naive或Th相似。为了证实两种不同CD4cyto表型的存在，作者比较了良性和恶性组织中CD4cyto的基因表达，发现了它们之间的遗传差异(图G)。为了进一步了解这些基因的功能和信号通路，又对三组CD4cyto进行了GSVA分析(图5I、J)。结果发现，PNT主要与炎症、细胞杀伤和能量代谢、促进平滑肌增殖有关，而PT和LNM以正调控能量代谢、激活多能干细胞、促进基底细胞癌变为主。
CD8+T
Tex主要分布于肿瘤组织中，其特征是缺乏正常CD8+T细胞的效应功能，以及高表达的抑制性受体。Trm是一种效应T细胞，高表达CXCL13、CTLA4和HAVCR2（图5E），不仅与Tex具有相同的标记物，而且保留了一定程度的效应功能。因此作者推测Trm可能会变成一种特定类型的Tex，这也与一项关于卵巢癌的研究结果相似。
图5
Result7 iCAF-TAM-Treg-Tex轴促进恶性细胞和TME的形成
为了解这些特定细胞群在TME中诱导的机制，作者使用CellChat分析了所有亚群的细胞间通信，共有84条信号通路，其中Tex表达最强(图6A- c)。因此，无论是激活信号还是抑制信号，Tex都是大多数信号通路的最终传递靶点。CAF与所有细胞亚群相关，是向免疫系统发送信号的主要细胞类型，如CXCL12-CXCR4轴，产生抗凋亡信号促进EMT，并将TAM招募到TME，然后TAM向免疫细胞发送抑制信号(图7)。从iCAF到TAM的其他途径包括:THY1、CSF、complement和ANGPTL(图D-G)。其中ITGB2不仅在TAM中表达，还在Treg、CD4Tcyto、naive T细胞和Tex中表达。从CAF到ITGB2的信号已被证明可促进肿瘤细胞增殖。同时，这也表明上述TME中表达ITGB2的CD4Tcyto的非细胞毒性亚型可能接受来自CAF的信号。另一个在信号通路中高表达的受体是CSF1R，在接收到iCAF信号后，这些TAM增殖并聚集成TME。
然后，作者分析了Treg在T细胞里的信号通路，发现Treg通过MHC I通路的一部分HLA-A/B/C/E向CD8Tcyto和Tex发出信号(图6H)。在TME中，恶性细胞和TAM通过释放HLA-A/B/C/E抑制自然杀伤细胞和细胞毒性免疫细胞的活性，并继续向肿瘤细胞招募M2巨噬细胞，关闭抑制信号通路的循环。
图6
图7
本研究通过scRNA-seq揭示了高级别和转移性膀胱癌具有庞大而复杂的细胞群及功能，增强了对高级别和转移性膀胱癌细胞和分子异同的新特征的理解，这可能为未来的治疗提供潜在的治疗靶点。
参考文献
Zheng Y, Wang X, Yang X, Xing N. Single-cell RNA sequencing reveals the cellular and molecular characteristics of high-grade and metastatic bladder cancer [published online ahead of print, 2023 May 11]. Cell Oncol (Dordr). 2023;10.1007/s13402-023-00820-x. doi:10.1007/s13402-023-00820-x
往期推荐
END
排版人：七七
原创声明：本文由欧易生物(OEBIOTECH)学术团队报道，本文著作权归文章作者所有。欢迎个人转发及分享，未经作者的允许禁止转载。
