小小果蝇竟暗藏玄机?高通量测序揭示黑腹果蝇样本疾病相关蛋白调节神经元形态的机制
RBP是RNA结合蛋白,伴随RNA生命始终,RBPs对于RNA的合成、选择性剪接、修饰、转运和翻译等生命活动的调控都具有关键作用,而且一个RBP可能存在多种靶标RNA,所以研究RNA和RBP的相互作用是探索RNA功能的关键。
Nab2基因编码一个保守的聚腺苷RNA结合蛋白(RBP),在转录后调控中具有广泛的作用,包括poly(A)RNA输出,poly(A)尾巴长度控制,转录终止和mRNA剪接。Nab2人类直系同源物ZC3H14的突变会引起常染色体隐性智力障碍,但目前尚未进行与后生动物Nab2/ ZC3H14相关的RNA转录本的全面鉴定,后生神经系统中Nab2/ ZC3H14功能的了解受到限制,许多Nab2/ZC3H14功能性蛋白的相互作用关系仍然不确定。本文作者提出证据表明 Nab2 与编码神经元翻译调节器的 Ataxin‑2 (Atx2) 发生遗传相互作用,并且这些因素协同调节神经元形态、昼夜节律行为和成人活力。使用 RNA 免疫沉淀测序 (RIP‑Seq) ⾸次对果蝇脑神经元中的 Nab2 和 Atx2 相关 RNA 进行高通量鉴定。测序结果显示,每个 RBP 的 RNA 相互作用组重叠,并且 Nab2 在其体内神经元中的 RNA 关联中表现出高度特异性。
共享相关转录物(例如,drk、me31B、stai)和 Nab2 或 Atx2 特异性转录物(例如,Arpc2 )的检出有助于深入了解每个 RBP 的神经元功能和遗传相互作用。Nab2 相关的神经元 RNA 在内部富含 A 的基序中过多,表明这些序列可能介导 Nab2 靶标选择。
智力障碍影响约 1%世界人口 的神经发育障碍 ,其定义为智力功能和适应行为显著受限。智力障碍的病因多种多样,在某些情况下遗传复杂,但许多人在一组相对有限的基本神经发育途径中表现出重叠的分子功能障碍。一组此类信息丰富的单基因智力障碍是由影响编码 RNA 结合蛋白 (RBP) 的基因的突变引起的 ,例如 ZC3H14(含有 14 的锌指 CCCH 类型)。具体来说,功能丧失突变ZC3H14 编码普遍表达的锌指多聚腺苷 RBP,可导致非综合征形式的常染色体隐性智力残疾。然而,人类 ZC3H14 的分子功能和发育作用在很大程度上是未知的。定义这些功能和角色为更好地了解智力障碍和人类神经发育提供了机会。
RIP-seq是研究细胞内RNA与蛋白结合情况,以RNA免疫共沉淀(RIP)为基础,采用特异抗体对RNA结合蛋白或者特殊修饰的RNA进行免疫共沉淀后,分离RNA,通过Illumina测序,在全转录组范围内研究被特定蛋白特异结合的RNA区域或种类,可比较多个样品间差异。
1.果蝇遗传学和饲养
黑腹果蝇已被证明是一个强大的模型系统,可以理解许多智力障碍基因编码的蛋白质的分子功能,其中就包括ZC3H14 。ZC3H14 的功能已开始部分通过对果蝇直系同源物 Nab2 的研究进行剖析。
本实验以果蝇为研究对象,在标准培养基上培养,并在 25 C 的加湿培养箱(SRI20PF,Shel Lab)中保持 12 小时明暗循环,培养物通常补充有颗粒酵母(红星酵母)以促进产卵。
2.果蝇眼睛成像
果蝇 Nab2 与 ZC3H14 一样,是一种多聚腺苷 RBP,当其表达改变时会引起神经缺陷;Nab2 的缺失或过表达会导致眼睛的神经元形态缺陷、发育中大脑的轴突投射缺陷和记忆障碍。
使用安装在Nikon SMZ800N立体显微镜上的Leica MC170 HD 数码相机以8倍放大率对果蝇眼睛进行成像。
3.免疫荧光
对于 Nab2‑Atx2 定位实验,将整只果蝇固定在 4% 多聚甲醛中,在室温下摇晃 3 小时,然后在 PBS 中洗涤并在 4°C 下储存过夜。使用如上所述的类似方法解剖大脑,经过封闭,一抗和二抗孵育过程后在 A1R HD25 共聚焦显微镜 (Nikon) 和多光子 FV1000 激光扫描显微镜 (Olympus) 上成像。
4.昼夜节律分析在羽化当天选择
将果蝇装入含有食物的单个聚碳酸酯管中,放入果蝇活动监视器(DAM,Trikinetics)中,并置于 25 C 下。所有果蝇最初都使用 12 小时光照/12 小时黑暗时间表进行夹带。在夹带的第三天之后,关掉灯,然后将果蝇安置在另外 7 天完全黑暗的环境中。在整个 10 天期间,为每只果蝇收集每分钟的光束中断次数。
5.免疫沉淀
RNA测序分析读取映差异表达和可视化:使用逐个基因的单向方差分析来识别基序显着丰富(即 RBP )后进行RNA测序分析。
1.Atx2的功能丧失等位基因抑制Nab2在雌性和雄性果蝇中眼部过度表达的影响。
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Figure 1 Loss-of-functionalleles of Atx2 suppress effects of Nab2 misexpression in female andmale Drosophila.
2. Atx2 功能丧失等位基因抑制Nab2对脑部形态的影响
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Figure 2 Loss-of-functionalleles of Atx2 specifically suppress axon morphology defects in Nab2ex3 MB a, but not b, lobes.
3. Nab2 丢失部分抑制了Atx2依赖性昼夜节律性心律失常
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Figure 3 Nab2 loss partially suppresses Atx2-dependent circadian arrhythmicity.
4. Nab2 和Atx2蛋白主要定位于不同的细胞区室,并在脑神经元中表现出有限的物理关联
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Figure 4 Nab2 and Atx2 proteins primarily localize to different cellular compartments and show limited physical association in brain neurons.
5. RIP-Seq 揭示了脑神经元中与Nab2-FLAG和Atx2-3xFLAG相关的重叠转录本集
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Figure 5 RIP-Seq reveals overlapping sets of transcripts associate with Nab2-FLAG and Atx2-3xFLAG in brain neurons.
以上实验数据表明,Nab2逆向调节神经元形态,并与Atx2共享相关的神经元RNA,果蝇Nab2与多腺苷酸化mRNA的更具体的子集相关。作者确定了Nab2 和Atx2在果蝇大脑形态、成人活力和昼夜节律行为中的功能相互作用,并定义了一组RNA转录本与脑神经元中对应的蛋白质。
蛋白质组学(Proteomics)是以蛋白质组为研究对象,研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征,包括蛋白质的表达水平,翻译后的修饰,蛋白与蛋白相互作用等,由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生,细胞代谢等生物学过程的系统描述。
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