Nat Comm | 国家纳米科学中心赵敏芝团队蛋白组揭示金纳米棒增强雷莫芦单抗的抗肿瘤机制

精准医学与蛋白组学

2021.12.08

景杰生物 | 报道
胃癌 (GC) 是中国乃至全世界最严重的恶性肿瘤之一，发病率和致死率都很高。近40年间，得益于肿瘤诊疗手段的快速发展，如胃癌相关分子靶点的发现，胃癌患者的五年相对生存率翻了一番。雷莫芦单抗（Ramucirumab, Ab）是FDA批准用于晚期或转移性胃食管腺癌的唯一靶向药，对曲妥珠单抗（Trastuzumab）耐药的患者亦有治疗优势。现今，纳米材料药物输送已广泛应用于生物医学研究领域[1]，利用纳米颗粒递送抗肿瘤药物可提高吸收效率，产生更好的治疗效果。
近日，中国国家纳米科学技术中心的赵敏芝教授团队在Nature Communications杂志发表了题为“Gold nanoparticles enhance antibody effect through direct cancer cell cytotoxicity by differential regulation of phagocytosis” 的文章。研究人员运用蛋白质组学等技术，发现雷莫芦单抗（Ab）附着在金纳米颗粒上可提高吸收效率。金纳米颗粒可以在Ab存在的情况下对癌细胞产生直接的细胞毒性作用，这种直接细胞毒性主要来自Ab介导的吞噬。

不同纳米载体和纳米药物在细胞水平的毒性作用

为了评估不同纳米载体和纳米药物在细胞水平的抗肿瘤作用，该研究选择了金纳米棒(AuNR) 及金纳米球 (AuSP)，通过聚乙二醇 (PEG) 与抗体Ranusirumab (Ab) 和化疗药物Doxorubicin (DOX) 联系起来。分别用Ab、PEG-Ab、AuSP-PEG-Ab或AuNR-PEG-Ab（1μg/mL Ab）处理GC细胞，通过共聚焦激光扫描显微镜成像和流式细胞仪进行检测（下图a-e）。此外，为了检测Ab在体内的集聚效果，研究人员将药物分别静脉注射到致瘤性BALB/c-nu小鼠体内，并检测主要器官的荧光强度（下图f-h）。结果表明Au-PEG-DOX可以显著抑制细胞的生存，且无论是否存在DOX，纳米载体在与Ab相关联时都可以加强对细胞存活性的抑制。此外，AuNR-PEG-Ab处理的细胞的促进作用明显高于AuSP-PEG-Ab组。

图 Ab和Au-PEG-Ab的肿瘤靶向能力

NR组和SP组细胞毒性多样性机制的蛋白组分析

为了揭示NR组（AuNR-PEG-Ab）与SP组（AuSP-PEG-Ab）对细胞的毒性多样性机制，研究人员进一步采用了基于质谱的定量蛋白质组学和转录组研究。研究共发现NR组与SP组有1490个蛋白质和3053个基因重叠（下图a,b）。虽然两组中差异基因的数量相似，但NR组的差异蛋白质数量明显更多。此外，研究人员还分别对NR组与SP组的蛋白质组与转录组结果进行了GO（下图e-j）和KEGG富集分析（下图k-l）。在这两类富集分析中，NR组的富集程度都远大于SP组。

图 NR组与SP组的定量蛋白质组学和转录组学分析

金纳米载体通过FcγR CD64介导的免疫相关吞噬直接调节癌细胞毒性

根据蛋白质组学和转录组学结果，研究人员发现其中有丰富的免疫过程和免疫相关受体。据报道，抗体可能导致与活性氧（ROS）直接相关的程序化细胞死亡（PCD）[2]，该过程可以通过次级抗体或FcγR表达细胞的Fc交联来增强[3]。因此，研究人员检测了Fcγ受体、高亲和力免疫球蛋白γ Fc受体I（CD64）和低亲和力免疫球蛋白γ Fc区域受体III-A（CD16）的mRNA和蛋白质表达水平。结果显示，胃癌细胞SNU5中高亲和受体CD64显著表达，低亲和受体CD16几乎不表达，而在正常胃上皮细胞GES-1中CD64和CD16均不表达（下图d,e）。因此，高亲和受体CD64在癌细胞中的强烈内源性表达，可能是纳米载药Ab细胞毒性的一个重要原因。

用不用浓度的Ab处理SNU5和GES-1细胞，流式分析结果表明正常胃上皮细胞即使在高附加浓度下也可能不吸收任何Ab，或者它不表达VEGFR2（下图b,c）。胃癌细胞SNU5可以是VEGFR2高表达细胞（下图e）。这可能是纳米载体组（NR和SP）无法诱导GES-1细胞死亡的原因，而这正是靶向治疗胃癌的另一个优势，即对正常的胃细胞不起细胞毒性作用。

图金纳米颗粒诱导肿瘤细胞毒性的潜在过程

纳米药物在体内抑制肿瘤生长

在体外实验的基础上，研究人员还通过SNU5异种移植小鼠模型进行了纳米药物体内免疫治疗效果的评估。具体是将20只小鼠随机分为四组（n=5），当肿瘤发育到大约100-200 mm3时，每周向小鼠注射一次AuNR-PEG-Ab（NR组）、AuSP-PEG-Ab（SP组）、Ab和PBS（100μL），定期记录肿瘤大小和小鼠体重。结果显示NR组小鼠肿瘤生长速度受到明显抑制，在四个组中治疗效果最佳（下图a,b）。H&E染色结果显示NR组肿瘤组织有显著损伤，但心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的形态与PBS治疗组没有明显差异，说明所有治疗组对其他正常器官均无明显损伤（下图c）。TUNEL检测结果显示NR组肿瘤细胞凋亡最明显。

图体内评估Ab连接纳米材料对肿瘤生长的作用
综上所述，该研究证明了金纳米棒可以诱导更强的生物反应，这种促进作用只有在抗体存在和辅助下才能生效。抗体可以提高纳米输送系统的体外和体内识别、吸收和积累效率。与Ab和纳米材料本身相比，纳米药物可以直接在GC细胞中诱导细胞死亡效应，但不影响正常胃细胞。根据蛋白质组学和转录组学结果，细胞毒性效应主要来自Fcγ受体介导的吞噬，并发现Fcgr1（CD64）作为Fcγ的高亲和受体基因，在纳米药物中受到上调，特别是在AuNR-PEG-Ab组。总之，简单的给药系统往往更有利于纳米材料在临床中的应用，以提高安全性和控制性，这也为金纳米棒更好地应用于胃癌药物输送治疗提供了思路。

图 AuNR-PEG-Ab-DOX的制备和给药
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参考文献：1. Santra, T. S., et al. 2014. Biosynthesis of silver and gold nanoparticles for potential biomedical applications - a brief review. Drug Deliv.2. Spratlin, J. et al. 2011. Ramucirumab (IMC-1121B): Monoclonal antibody inhibition of vascular endothelial growth factor receptor-2. Current Oncology Reports.
3. Overdijk, M. B. et al. 2016. The therapeutic CD38 monoclonal antibody daratumumab induces programmed cell death via Fcgamma receptormediated cross-linking. J Immunol.
4. Linyang Fan, et al. 2021. Gold nanoparticles enhance antibody effect through direct cancer cell cytotoxicity by differential regulation of phagocytosis. Nature Communications.本文由景杰学术团队报道，欢迎转发到朋友圈。如有转载、投稿等其他合作需求，请文章下方留言，或添加微信ptm-market咨询。