项目文章J Integr Plant Biol（IF 9.1）| 浙江大学丁忠杰教授团队通过泛素化修饰组揭示植物叶片衰老新机制

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项目文章J Integr Plant Biol（IF 9.1）| 浙江大学丁忠杰教授团队通过泛素化修饰组揭示植物叶片衰老新机制

中科新生命蛋白代谢多组学

2022.12.01

衰老是植物生命周期中不可缺少的过程，而植物激素在叶片衰老过程中起着关键作用，其中脱落酸(ABA)、乙烯、茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)是促进叶片衰老的重要物质。其中ABA介导植物的多种生理过程，如气孔关闭、叶片衰老、种子休眠和渗透调节等。尽管ABA的生物合成和信号转导以及它们的调控已经得到了广泛的了解，但ABA是如何通过转运被调节的还不清楚。

2022年5月，浙江大学丁忠杰教授团队于Journal of Integrative Plant Biology (IF 9.106)发表了题为“RING‐box proteins regulate leaf senescence and stomatal closure via repression of ABA transporter gene ABCG40”文章，通过转录组学及修饰蛋白质组学，研究发现了两种未被鉴定的RING-box蛋白，衰老泛素连接酶1和2 （ULS1和ULS2），并证明其在ABA信号反馈抑制中作为ABCG40依赖的ABA转运负调控因子，控制叶片衰老和气孔关闭，这对ABA转运调控及其对叶片衰老影响的理解提供了帮助。其中，中科新生命为该研究提供了泛素化修饰蛋白质组学服务。

ULS1和ULS2在叶片衰老和气孔关闭中的作用模型

研究材料

野生型拟南芥及其突变体

技术路线

步骤1：缺乏ULS1和ULS2促进叶片衰老；

步骤2：探究ULS1/2的表达模式；

步骤3：ULS1和ULS2功能的丧失促进ABA诱导的叶片衰老；

步骤4：ULS1/2抑制成熟叶片中ABA的积累；

步骤5：RNA‐seq揭示uls1/uls2中高表达ABA的转运基因ABCG40；

步骤6：ULS1/2介导的叶片衰老依赖于ABCG40；

步骤7：ULS1/2参与ABCG40依赖的气孔运动；

步骤8：定量蛋白质组学揭示uls1/uls2中存在差异的泛素化蛋白。

研究结果

1. 缺乏ULS1和ULS2促进叶片衰老

作者首先基于拟南芥现有的基因表达模式，发现两个属于RING‐V组的基因在衰老叶片中表达增加，并将其命名为ULS1和ULS2。接着作者通过生成一个双突变体uls1/uls2，发现其比野生型和单突变型的叶片衰老明显提前，叶片鲜重和叶绿素含量均降低。此外在此双突变体中构建原生启动子驱动的ULSI和ULS2，发现这两个基因均使uls1/uls2的叶片衰老程度恢复到野生型的水平。这些结果表明，ULS1和ULS2参与抑制拟南芥叶片衰老的过程。

图1 ULS1和ULS2功能的丧失促进拟南芥叶片衰老

2. ULS1/2的表达模式

作者通过蛋白荧光表达，发现ULS1和ULS2主要在细胞质和内膜系统中表达，并且在叶绿体中显著富集。为了确定ULS1和ULS2的组织定位，作者构建了由ULS1/2原生启动子驱动的表达GUS的转基因株系（P_ULS1:GUS和P_ULS2:GUS），通过GUS染色，发现ULS1和ULS2主要表达在茎和根的维管组织中，在老叶中的表达高于幼叶，同时其在保卫细胞、下胚轴及花中也进行表达。此外，作者使用RT‐qPCR检测发现ULS1和ULS2在未衰老的成熟叶(NL)和老叶(OL)中高度表达，ULS1同样在花和角果中高度表达，表明其主要在成熟和衰老叶片中表达。

图2 ULS1和ULS2的表达模式

3. ULS1和ULS2功能的丧失促进ABA诱导的叶片衰老

为了探讨ULS1和ULS2是如何参与叶片衰老过程的，作者分别用ABA、SA、MeJA、ACC和黑暗条件处理WT和uls1/uls2突变体的未衰老成熟叶片。结果表明，突变体uls1/uls2叶片衰老加速，叶绿素含量较对照组低。值得关注的是，只有ABA对uls1/ uls2突变体叶片衰老的促进作用明显大于WT，这表明ULS1和ULS2可能参与了ABA诱导的叶片衰老。为了验证这一结果，作者测定了WT和uls1/uls2在添加或不添加ABA处理的离体叶片中与衰老相关基因的转录水平。结果表明，与WT相比，uls1/ uls2叶片中叶绿素分解代谢基因(NYC1和NYE2)和衰老特异性基因(SAG12和SAG13)的表达显著增加。此外，ABA能显著提高uls1/uls2叶片中的基因转录水平，其中ULS1和ULS2的mRNA水平明显受到ABA的诱导。这些数据表明，ULS1和ULS2可能在ABA诱导的叶片衰老过程中起负调控作用。

图3 uls1/uls2对ABA诱导的叶片衰老异常敏感

4. ULS1/2抑制成熟叶片中ABA的积累

为了确定ULS1/2如何影响ABA诱导的叶片衰老，作者将拟南芥叶片分为三个发育阶段，即ST1(早熟或幼叶)、ST2(成熟叶)和ST3(老叶)，并分别测量了叶片中的ABA含量。结果表明在WT和uls1/uls2植株中，ABA含量都随着叶片发育而增加。此外，在ST2期，特别是ST3期，uls1/uls2叶片中的ABA积累远高于WT。这些数据表明，ULS1和ULS2可能通过抑制衰老叶片中ABA的积累来抑制叶片衰老。

图4 突变体植株成熟叶中ABA含量增加

5. RNA‐seq揭示uls1/uls2中高表达ABA的转运基因ABCG40

为了进一步探索ULS1和ULS2调控叶片衰老的分子机制，利用RNA‐seq对WT和uls1/uls2不同阶段叶片中差异表达基因进行了鉴定。结果表明，在三个发育阶段均有显著性差异的50个基因中，ABA转运体基因ABCG40的差异表达最为显著，并通过RT-qPCR证实了这一结果。此外，在uls1/uls2离体叶片中，ABCG40的表达水平要高得多，且在ABA处理后进一步增强。这些结果表明，ABCG40的高表达可能是uls1/uls2突变体ABA积累和叶片衰老的原因之一。

图5 uls1/uls2叶片在不同发育阶段的差异基因表达

6. ULS1/2介导的叶片衰老依赖于ABCG40

紧接着作者开始验证ULS1和ULS2是否通过ABCG40调节叶片衰老。他们通过构建三重突变体uls1/uls2/abcg40，发现相比较于uls1/uls2，三重突变体在叶片衰老过程中表现出类似WT的表型。此外，与uls1/uls2相比，uls1/uls2/abcg40中衰老相关基因SAG12和NYC1的表达显著降低。这些结果表明，在缺乏ULS1和ULS2的植物中，ABCG40是导致叶片早期衰老的主要因素。为了进一步证实ABCG40是否有助于增加uls1/uls2中ABA的积累，作者测定了ST3期叶片中的ABA含量，发现uls1/uls2/ ABCG40中ABA的积累明显低于uls1/uls2。综上这些数据表明，缺乏ULS1和ULS2会增加ABCG40的表达，进而促进叶片中ABA的积累，导致叶片加速衰老。

图6 ULS1和ULS2通过ABCG40参与叶片衰老

7. ULS1/2参与ABCG40依赖的气孔运动

由于ABA诱导的气孔关闭需要ABCG40，因此作者接下来探究ULS1和ULS2是否参与气孔运动的调节。与WT相比，在对照和ABA处理下，uls1/uls2的气孔孔径显著减小，而abcg40突变可以很大程度上抑制uls1/uls2的气孔关闭，这表明ULS1/2在ABCG40依赖的气孔运动中起作用。与此一致的是，uls1/uls2的叶片失水率明显低于WT和uls1/uls2/abcg40突变体。

图7 ULS1和ULS2通过ABCG40调节气孔孔径

8. 定量蛋白质组学揭示uls1/uls2中存在差异的泛素化蛋白

接下来文章进一步挖掘ULS1/2如何影响ABCG40的表达。作者从4周龄的WT和uls1/uls2植物中取样未衰老的成熟叶片，通过Label Free定量蛋白质组学检测体内泛素化。结果表明共有65个在WT和uls1/uls2之间泛素化差异显著的蛋白，其中15个蛋白参与ABA响应和衰老过程，支持ULS1/2在ABA诱导的叶片衰老中的作用。此外，ABC转运蛋白，特别是ABCG40，是uls1/uls2中泛素化水平最高的蛋白之一，表明ABCG40在uls1/uls2植物中丰富，其泛素化受到ULS1/ULS2的间接影响。