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Cell封面 | 空间蛋白组又一里程碑！Matthias Mann团队绘制器官的三维立体空间分子图谱

精准医学与蛋白组学

2022.12.27

景杰生物 | 报道

许多疾病在早期阶段，部分组织区域会产生病变。识别并绘制复杂组织的空间分子图谱以解读组织异质性，对于理解细胞生理和病理状态至关重要。超高灵敏度质谱法的发展使蛋白质组空间层面的分析成为可能。2022年5月，德国马克斯·普朗克生化研究所Matthias Mann团队在国际顶级学术期刊Nature Biotechnology发表最新文章，描述了一种名为深度视觉蛋白质组学 (DVP) 的空间蛋白组方法，它将组织细胞成像与超高灵敏度质谱法相结合，绘制了组织“二维”层次的空间分子图谱。

图 DVP技术的概念和工作流程

然而，对整个器官和生物体的组织区域的空间组学分析仍然具有挑战性。虽然新兴的组织透明化技术 (tissue clearing technolog) ，能帮助科研人员利用光学显微镜对器官进行3D观察，结合人工智能分析准确快速识别微小改变。但是单单指出病变的区域，无法帮助解答其分子层面的变化与致病机制。全器官透明化成像技术是否与空间蛋白质组学技术兼容也尚不清楚。

2022年12月22日，国际顶刊Cell 以封面文章形式发表了Matthias Mann团队和慕尼黑亥姆霍兹中心组织工程与再生医学研究所 (iTERM) Ali Ertürk团队合作题为Spatial proteomics in three-dimensional intact specimens 的文章。研究团队将组织/生物体透明化和成像技术、图像分析与智能组织提取技术，和超高灵敏度质谱技术进行结合，开发了一种新的空间蛋白组学技术DISCO-MS，实现对全组织区域进行无偏的空间蛋白组学分析，并保留其三维立体空间背景信息，以发现各种疾病模型中初始病理事件相关的空间-分子图谱。研究团队运用该技术绘制了从完整小鼠和人类器官分离的目标区域的空间蛋白组分子图谱，揭示了小鼠脑组织、骨髓组织和人类心脏动脉斑块的异质性。

(视频来源: Cell官网）

01. 组织透明化技术与空间蛋白组分析

组织透明化技术是指通过化学试剂处理让动物的全身或整个器官变得透明，然后利用三维组织染色和成像方法，让特定类型的细胞或组织在透明身体中呈现出来。那么组织透明化处理是否会影响样本的蛋白质组特征及定量？针对这一疑问，研究团队采用小鼠和人体组织样本为研究对象，比较了多种主流透明化方法 (包括3DISCO、uDISCO和团队开发的vDISCO方法) ，证实即使是最苛刻的有机溶剂组织透明化方法，组织透明化处理后其蛋白质组成分、分析深度及定量准确度未发生明显变化，与新鲜组织及多聚甲醛固定质控样本非常接近 (图1) 。包括vDISCO在内的所有透明化处理条件下，均可获得较高的分析深度 (鉴定到超过6，000种蛋白质) 和定量准确度 (Pearson相关性范围为0.85 - 0.94) (图1A) 。

图1 组织透明化技术与空间蛋白组分析

02. 三维立体空间蛋白质组学技术DISCO-MS

随后，研究人员将组织/生物体透明化和成像技术、和超高灵敏度质谱技术进行结合，开发出三维立体空间蛋白质组学工作流程DISCO-MS (3D imaging of solvent-cleared organs profiled by mass spectrometry) (图2A) 。该技术流程的创新点包括：1.调整透明化步骤，对透明化组织进行再水化后冷冻保存，使清除的刚性组织变软，避免了冷冻切片过程中组织破裂，从而允许激光显微切割 (LCM) 小至0.0005 mm3的组织区域 (相当于约60个细胞) ;2.样本制备流程小型化，结合改良的高灵敏度4D质谱平台，在单细胞高灵敏度水平开展纳克级别的组织蛋白质组学定量;。3. 通过人工智能，实现2D激光捕获显微切割图像和3D光片成像的对应匹配 (图2B、C) 。即LCM切割后，对这些图像进行对齐，以生成LCM切片的重建3D成像，然后将这些切片与片光成像堆栈的子集进行逐层协调，最终使用得分最高的切片将感兴趣区 (ROI) 投影到3D片光成像数据上。

图2 三维立体空间蛋白质组学技术DISCO-MS工作流程示意图

03. 创伤性脑损伤 (mTBI) 小鼠模型的3D空间蛋白组分析

研究团队运用DISCO-MS工作流程，在创伤性脑损伤 (mTBI) 小鼠模型中对含有局部分散炎症的区域进行了分析，证实了技术的应用潜能，能够在异质性组织区域获得无偏的蛋白质组学信息。研究人员沿着视束区域活化的小胶质细胞，使用LCM获取3个相邻的ROIs进行蛋白质组学分析 (图2B和2C) 。质谱分析在每个ROI样本中定量到多达1400个蛋白，mTBI和假手术对照组的所有ROI中包含602种共同蛋白，并揭示了mTBI组的ROI区域的共有蛋白质组特征及各ROI区域的独特蛋白质组特征 (图3D) 。主成分分析 (PCA) 对比mTBI和假手术对照组之间的蛋白质组差异 (图3E) ，一些与轴突损伤和修复相关的蛋白质在不同条件下受到强烈的差异性调节。

图3 创伤性脑损伤 (mTBI) 小鼠模型的3D空间蛋白组分析

04. AD小鼠全脑组织的的3D空间蛋白组分析

阿尔兹海默症 (AD) 的一个早期特征是淀粉样蛋白β (Aβ) 斑块的沉积，早期研究从AD小鼠的溶解全脑中获得了蛋白质组学图谱，或提供了预选脑区斑块病理学的平均信息，但没有斑块位置的空间细节。研究人员因此选择AD为研究对象，采用5xFAD小鼠模型，使用透明化成像技术结合深度学习方法在小鼠全脑中扫描识别所有Aβ斑块位置。研究获取到AD早期和晚期 (6个月) 超过1000个脑亚区的区域斑块数据信息，将其映射到Allen大脑图谱，并标注出27个与疾病相关的区域。随后研究团队使用DISCO-MS技术分离了4个单个斑块区域 (体积：0.0005mm³) 进行了蛋白质组学分析 (图4A-4D) ，获得了单斑块微环境的蛋白质组学数据及其对应的空间位置信息。研究结果揭示了斑块相关蛋白的上调具有区域特异性，并定义了一个早期斑块形成的核心蛋白质组。和邻近的无斑块区域相比，斑块区域与囊泡融合与转运，分泌途径相关的蛋白存在显著变化，提示其可能是早期AD起始标志。

图4 DISCO-MS揭示AD小鼠模型中的单个斑块蛋白质组

05. 人类心脏组织的DISCO-MS分析

随后，研究团队将DISCO-MS应用于人类心脏器官，绘制其3D空间分子图谱。为满足大体积样本 (如整只成年小鼠及完整人类器官等) 的自动化、微量、准确提取需求，研究团队开发了一套机械组织提取系统DISCO-bot (图5A) ，该系统能与数字扫描激光显微镜协作，在成像时提取透明化组织的微小组织区域，用于后续DISCO-MS研究。研究团队获取了具有动脉粥样硬化斑块的人类心脏样本，使用SHANEL透明化技术将其全透明化，并精确定位斑块相关区域的空间分布。随后分别在大的斑块相关区域和小 (无) 斑块区域提取了6个ROIs，进行DISCO-MS研究。研究在每个ROI共定量到1300蛋白，发现在早期冠状动脉斑块形成过程中，心脏肌肉收缩、血液凝固等途径相关蛋白表达上调，其中一些变化呈现区域特异性，并鉴定鉴定了与CAD相关的分子，如GLO 1、CA 6、MYH 6和MACROH2A.1。

图5 动脉粥样硬化斑块的人类心脏的空间蛋白组分析

综上所述，研究介绍了全新的空间无偏蛋白质组学技术 (DISCO-MS) ，包括全器官/生物体3D立体透明化成像，深度学习为基础的成像分析，机械组织提取和超高灵敏度质谱分析。该技术具有良好的适用性，能够对小鼠/人类等3D全样本成像后的器官/组织进行无偏的蛋白质组学分析，并保留其器官水平的空间背景，为空间分子异质性和生物学多样性研究提供了全新视角和有力武器。

空间蛋白质组学技术有助于分析疾病早期及特定病理环境的空间-分子基础，为复杂疾病提供更多诊断和治疗机会。研究团队探索性的将该方法应用于早期AD疾病模型小鼠的全脑组织及动脉粥样硬化斑块的人类心脏组织，绘制了相应组织的三维立体空间分子图谱，揭示了组织与疾病的异质性，这对于疾病的认知与局部靶向治疗至关重要。

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