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项目文章|SCI ADV (IF：14.957）浙江大学医学院研究代谢产物ADMA介导骨关节炎发展

鹿明生物

2023.4.26

前言

2023年02月，浙江大学医学院范顺武教授/课题组在 Science Advances期刊发表的题为 “Metabolite asymmetric dimethylarginine (ADMA) functions as a destabilization enhancer of SOX9 mediated by DDAH1 in osteoarthritisx ”（IF：14.957）的研究成果，通过非靶向代谢组学技术、组织学和免疫组织化学、蛋白质免疫印迹技术、蛋白质组学技术、Nano–LC-MS/MS等研究方法，发现了OA软骨细胞特征，探究了OA中ADMA调节的潜在机理，描绘了ADMA参与OA进展图谱，为OA诊断提供了理论依据。

基本信息

中文标题：代谢物不对称二甲基精氨酸作为SOX9的失稳增强剂DDAH1介导骨关节炎

研究对象：人软骨组织

发表期刊：Science Advances

影响因子：14.957

发表时间：2023年2月

合作单位：浙江大学医学院

运用生物技术：非靶向代谢组学技术、组织学和免疫组织化学、蛋白质免疫印迹技术、流式细胞术、蛋白质组学技术、Nano–LC-MS/MS

研究背景

骨关节炎（OA）是一种退行性疾病，主要由老化和机械损伤引起。在OA软骨细胞中，分解代谢调节因子释放多种炎症因子，最终导致细胞外基质（ECM）变性，使OA的发病机制陷入恶性循环。退化的软骨细胞和OA中，下调的二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶-1（DDAH1）伴随着不对称二甲基精胺酸（ADMA）的增加。ADMA诱导软骨细胞变性和衰老，并减少ECM沉积，而加速OA发展。研究ADMA在OA中的作用及对OA的影响，探究ADMA调节下游的潜在机制。

研究思路

研究方法

1.实验分组

1）DMM模型：C57BL/6小鼠，雄性，12周

2）老年OA模型组：C57BL/6小鼠

3）老年OA模型对照组：C57BL/6小鼠，4个月大

4）自发性OA模型组：OA STR/Ort小鼠

5）自发性OA模型对照组：CBA/CaCrl小鼠

2.技术路线

1)动物行为学测定：热板法、旋转棒法和6分钟距离法

2) LC-MS：细胞ADMA检测

3)显微CT分析：小鼠软骨组织

4)微物质培养：评估ECM沉积

5)3D琼脂糖培养：软骨细胞

6)实时定量PCR分析：QuantStudio 6 Flex实时PCR系统

7)细胞计数试剂盒-8测定：软骨细胞

8)NO测定：NO检测法

9)GST pull-down：检测蛋白质

3. 统计分析

Shapiro-Wilk检验、Levene检验、配对或非配对双尾t检验、Dunnett检验的单因素方差分析、Kolmogorov-Smirnov检验、Kruskal-Wallis检验、Dunn多重比较检验、Pearson相关分析ROC。

研究结果

1.OA软骨细胞中ADMA的增加触发软骨变性

OA患者和患者软骨细胞的代谢组学证明了代谢产物的一系列改变（图1A）。LC-MS确认OA软骨细胞中ADMA水平升高，其异构体对称二甲基精氨酸（SDMA）的变化（图1B）。

微质体培养和3D琼脂糖培养结合衰老相关（SA）-β-半乳糖苷酶染色表明，ADMA减少了软骨细胞中ECM的沉积并诱导了软骨细胞衰老（图S1，C-E）。

低浓度的短脉冲刺激或长时间刺激下，ADMA的小鼠软骨细胞合成代谢因子、分解代谢因子MMP13和衰老标志物P21以剂量依赖的方式下调（图S1F）。

免疫组织化学染色证实，暴露于ADMA软骨中的II型胶原和聚集蛋白聚糖的表达降低（图S1H）。热板分析、旋转棒分析和开放场分析显示，注射ADMA的小鼠疼痛阈值和运动能力显著较低（图S1I），说明退化的软骨细胞中ADMA的增加会引发软骨退化和衰老。

图1 | DDAH1上调ADMA加速OA形成

2.下调的DDAH1负责OA中ADMA的升高

与非OA组织相比，DDAH1在OA组织中的RNA表达较低，而DDAH2的RNA表达较高（图S2C）。通过三种不同的OA动物模型表明，DDAH1在OA中被抑制，从而增加软骨细胞中ADMA水平（图1C-D）。

免疫印迹蛋白技术和免疫组织化学证实了DDAH1的缺失（图1H和图S3A）,微质体培养和3D琼脂糖培养显示DDAH1^−/−原代软骨细胞中ECM沉积较低（图1E-F）。

20周龄的DDAH1^−/−小鼠中DDAH1缺失，显著加速了DMM诱导的OA小鼠的软骨退化（图1G）,免疫组织化学显示DDAH1^−/−小鼠软骨中II型胶原和聚集蛋白聚糖减少（图1H）。

3. 软骨特异性DDAH1参与OA进展

RT-PCR显示合成代谢因子（COL2A1和ACAN）减少，代谢因子（MMP3和MMP13）增加（图2A），聚集蛋白聚糖和COL2A1的蛋白表达显著DDAH1缺失后下调（图2B），软骨中DDAH1的缺失可能导致DMM术后严重的软骨损伤（图2C和图S5C）。

在Col2-CreER^T2、DDAH1^fl/fl和ACAN-CreER^T2小鼠软骨中II型胶原和聚集蛋白聚糖的蛋白表达显著降低（图2D和图S5D），DDAH1^fl/fl、Col2-CreER^T2和DDAH1^fl/fl、ACAN-CreER^T2小鼠中则观察到较多的骨赘和较高的软骨下骨体积（图2E-F和图S5E-F）。

这些数据表明软骨特异性DDAH1敲除对OA进展至关重要，而DDAH1的过表达对OA具有治疗作用。关键合成代谢因子II型受损软骨中DDAH1过表达后，膝关节软骨中的胶原和聚集蛋白聚糖显著上调（图S6B）。

热板、旋转杆和6分钟距离法表明其疼痛阈值显著提高（图S6C）。LC-MS证实了DDAH1过度表达的软骨细胞可降低ADMA（图S6D）。表明DDAH1可部分逆转DMM诱导的OA。

图2 | 软骨特异性敲除DDAH1加速OA进展

4.ADMA激活SOX9的泛素蛋白体途径

KEGG分析揭示了几种富集的OA相关途径，如ECM受体相互作用、TNF信号通路、细胞衰老和糖胺聚糖生物合成（图3A）。火山图显示了上调的分解代谢因子、衰老标志物和炎症趋化因子及下调的合成代谢因子（聚集蛋白聚糖、COL2A1和SOX9）（图3B）。在ADMA或DDAH1缺失的软骨细胞中，SOX9蛋白表达下调（图3D-E）。

免疫组织化学显示，SOX9的表达来自PD 404182或DDAH1^fl/fl、Col2-CreER^T2和DDAH1^fl/fl，ACAN-CreER^T2小鼠（图3F-H）。ADMA中的SOX9半衰期短于对照细胞，证明ADMA导致了SOX9的不稳定。而MG132阻断了SOX9的衰变而氯喹却没有，表明SOX9的降解依赖于蛋白酶体途径，而不是溶酶体途径（图3I-J）。

ADMA诱导了SOX9衰变，并在过表达的DDAH1软骨细胞中部分逆转，通过泛素-蛋白酶体途径触发了SOX9的降解，增加了SOX9的水平（图3 K -L）。

图3 | ADMA通过泛素-蛋白酶体途径诱导SOX9降解

5.ADMA阻断SOX9与USP7交互途径

UbiBrowser数据库预测生物素ADMA和SOX9相关E3泛素连接酶或去泛素化酶（DUBs），发现DUBsUSP7可能参与其中(图4A-B)。GST-SOX9和His-USP7重组蛋白与生物素ADMA分别孵育，发现SOX9和ADMA（或USP7和ADMA）之间存在直接相互作用（图4C-D）。

共聚焦显微镜显示USP7和SOX9共定位，ADMA处理细胞后，SOX9的荧光信号减弱，而USP7没有改变（图4-F)。分子对接技术预测ADMA、USP7和SOX9之间相互作用模型，发现ADMA可阻断SOX9和USP7之间的相互作用区域，并可减弱其相互作用(图4 G-H)。

ADMA刺激免疫印迹中SOX9蛋白水平导致不平衡，调整SOX9蛋白水平后发现，ADMA处理的软骨细胞中USP7和SOX9之间的相互作用减少(图4I)。GST下拉分析验证了USP7和SOX9之间的直接结合作用可被ADMA部分阻断（图4J）。

抑制USP7后，ADMA未能影响SOX9的表达和泛素粘附在SOX9上的表达 (图4K-L)。DMM术后1周，将USP7 AAV关节注射到DDAH1^fl/fl、Col2-CreER^T2小鼠膝关节，免疫组化结果显示，DMM术后8周软骨损伤得到明显修复，SOX9、II型胶原蛋白和聚集蛋白表达分别增加(图4M-N)。

图4 | ADMA阻止SOX9和USP7之间的交互途径

6. 滑膜液中的ADMA是一种潜在的OA诊断指标

近几十年来，OA的诊断主要依赖于临床症状和放射学。而在临床实践中，OA患者的软骨细胞和滑液中ADMA显著增加。ADMA能够区分OA患者和相对健康的患者，并且在早期诊断OA方面具有良好的敏感性和特异性。尽管需要更多的样本，但滑膜液中的ADMA可能仍然是OA诊断的潜在生物标志物。

图5 | 滑液中ADMA可预测OA的诊断

相关讨论

OA发病过程中，软骨细胞中的许多酶发生变化，导致一系列代谢变化，使其某些代谢产物可能是OA的诊断标志物，代谢产物ADMA的增加，伴随着DDAH1的下调。受DDAH1调节，ADMA通过促进软骨细胞变性和衰老而加速OA的发展，而不是依赖于NOS/NO通路。ADMA直接与SOX9和USP7结合，并阻断相互作用区域。

SOX9的降解依赖于蛋白酶体途径，而不是溶酶体途径，通过促进SOX9泛素-蛋白酶体途径进行降解，增加SOX9的水平。

研究结论

通过研究表明，OA软骨细胞滑液中ADMA显著增加，对早期OA诊断具有良好的敏感性和特异性，且能够区分OA患者和相对健康患者，说明滑液中的ADMA可能是诊断OA的潜在标志物，对OA早期诊断具有预测价值。ADMA的增加伴随着软骨细胞中DDAH1的下调，可在体内和体外诱导软骨细胞基质降解，促进软骨细胞变性和衰老，加速OA的进展。揭示了ADMA的靶点，并探讨了ADMA调节的潜在机制。

文章推荐

文章通过非靶向代谢组学技术、蛋白质组学技术、Nano–LC-MS/MS等技术，探究了ADMA在OA软骨滑液中的作用，及对OA早期诊断的预测价值。ADMA受DDAH1调节，揭示了ADMA的靶点，即靶向DDAH1可能为OA治疗提供新方向。