木犀草素对小鼠甲状腺炎的抗炎作用研究

自身免疫性甲状腺炎是自身免疫引起的一种慢性甲状腺炎病症，病因及发病机制尚不完全清楚，可能与机体的体液免疫、细胞免疫和免疫复合物异常有关。建立甲状腺炎免疫动物模型，能够很好地应用于对自身免疫性甲状腺疾病的发病机制及其治疗的研究。木犀草素是一种天然黄酮类化合物，不仅具有抗炎、抗氧化以及对神经系统的保护等作用，还具有抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡以及增敏抗癌药物活性等抗肿瘤作用。我国有研究者进行了木犀草素对小鼠自身免疫性甲状腺炎(EAT)的抗炎作用研究。

自身免疫性甲状腺炎(AIT)又称慢性淋巴细胞性甲状腺炎或桥本氏甲状腺炎，其发病率仅次于甲亢，占甲状腺疾病的20％左右。目前制作AIT免疫动物模型的方法主要有T细胞减除法、免疫介导法和高碘诱导法等。通过Tx-X处理减除Ts细胞诱发产生的AIT，不需要外源性给以自身抗原和免疫佐剂是其优势，但是，利用甲状腺自身抗原成分如甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶、促甲状腺激素受体单独或加用佐剂(如LPS、CFA等)免疫动物依然是公认的经典方法。

动物模型对于研究各种疾病的机制、单个基因的功能以及许多药物和化学药品的功效和毒性有着巨大的贡献，是生物医学研究中不可或缺的工具。美迪西可以根据客户的需求提供各种有效的炎症疾病模型和免疫性疾病动物模型，用来检测药物的有效性。常规的炎症和免疫性疾病有：急性炎症、关节炎、实验性过敏性脑脊髓炎等，通过大小鼠进行动物实验。

BALB/c小鼠在癌症治疗和免疫学研究中有着广泛应用，可用于免疫动物模型的建立。BALB/c小鼠是一种白化、免疫缺陷的杂交品系。BALB/c小鼠有着易于繁殖和雌雄体重差异小的特点。值得注意的是BALB/c小鼠的乳腺癌发生率低，但对致癌物非常敏感，可以培育肺癌、网状肿瘤、肾癌以及其他癌症。另外，对BALB/c品系注射矿物油可迅速引发浆细胞瘤，该品系被广泛应用于杂交瘤和单克隆抗体的生产。

论文研究作者建立了自身免疫甲状腺疾病(AITD)中Graves病(GD)和甲状腺相关性眼病(TAO)的动物模型，以IL-6/STAT1、STAT3为靶点研究木犀草素对小鼠自身免疫性甲状腺炎(EAT)的抗炎作用。作者首先将20只8周龄雌性BALB/c小鼠共分为3组，造模组(T289组)10只，对照组(pcDNA3.1组)5只和空白组(Control组)5只。使用过表达TSHRA亚单位的重组质粒pcDNA3.1-TSHR289对T289组和pcDNA3.1组小鼠进行基因免疫，免疫后立即给予电穿孔法进行体内转染，每3周1次，共免疫4次，末次免疫后第1周使用7.0T微型MRI仪检测免疫组和空白组小鼠眼球及眼外肌的变化，末次免疫后第2周处死小鼠。ELISA法检测小鼠血清总T4、TRAb抗体水平，甲状腺和眼部组织病理切片行HE染色、免疫组化和阿辛蓝染色。

然后该研究作者将30只8周龄雌性C57BL/6小鼠分为4组，分别为造模组(TG组)10只、木犀草素(Luteolin组)组10只、地塞米松组(阳性对照组，DEX组)和空白组(Control组)各5只。将100μg的猪甲状腺球蛋白(pTG)(浓度1mg/ml)和100μl的弗氏完全佐剂完全乳化之后，给予TG组、Luteolin组和DEX组小鼠皮下注射(100μg/只)。

第14天，再使用同样剂量的pTG和弗氏不完全佐剂乳化，给予以上组小鼠第二次皮下注射。从末次注射后第1天开始，每天分别给予木犀草素组和地塞米松组小鼠腹腔注射相应的药物，木犀草素剂量为10mg/kg/day，地塞米松剂量为5mg/kg/day，空白组给予PBS。用药7天后，在第21天处死小鼠。ELISA法检测小鼠血清总T4、TGAb抗体水平，甲状腺切片行HE染色。同时建立Raw264.7细胞炎症模型：将体外培养的Raw264.7细胞接种到6孔板，加入IFN-γ(10ng/ml)培养过夜。第二天加入木犀草素(20μmol/l)处理6h。注意设置对照组及空白组。提取细胞内总蛋白，行westernblot检测细胞内的STAT1、STAT3、环氧合酶2(COX2)的蛋白水平。

研究发现约80%的造模小鼠出现了甲状腺功能亢进的表现，包括甲状腺肿、病理学上甲状腺滤泡上皮细胞明显的肥大和增生及轻微的甲状腺炎、血清中T4水平和TRAb水平的显著上升。同时也观察到造模小鼠眼裂增宽(约30%)、MRI显示眼外肌体积增大、眼外肌中T淋巴细胞的浸润(约50%)及透明质酸的聚集(约30%)，均符合人类Graves甲亢与眼病的表现，成功构建了GD与TAO的小鼠模型。

结果成功构建了EAT模型，40%左右的造模组小鼠均有甲状腺不同程度的肿大。50%左右造模组小鼠的甲状腺HE染色出现单核细胞的浸润，Luteolin组、DEX组(阳性对照)和Control组小鼠无单核细胞的浸润。

甲状腺免疫组化结果显示木犀草素显著减少甲状腺内STAT1与STAT3的表达。Raw264.7巨噬细胞模型中，木犀草素明显抑制IFN-y诱导的细胞内COX2、磷酸化STAT3(Y705位点)和磷酸化STAT1(Y701位点)的升高，而总STAT3和STAT1保持不变。因此该实验成功构建了Graves甲亢和TAO小鼠模型，为Graves病发病机制与新型药物的研究提供了一个很好的工具。

在甲状腺炎免疫动物模型上的研究发现，木犀草素抑制了EAT早期甲状腺内单核细胞的浸润，减轻甲状腺上皮细胞的破坏，为HT的早期干预药物的研究提供了新的思路。