测定食品中蛋白质含量对健康的重要性
蛋白质是一类最重要的生物大分子，存在于一切生物体内，是细胞的主要成分，是生命的基础物质，是一种纯天然的营养物质，也是一种天然的表面活性剂。蛋白质的结构受二硫键的影响很大，而蛋白质的结构影响蛋白质的表面活性性能，为了研究蛋白质的结构和性能的关系，特别是蛋白质表面活性性能与结构的关系，所以测定蛋白质二硫键含量尤为重要。
目前，普遍采用的是Ellman建立的方法，即利用5,5'- 二硫代-2-硝基苯甲酸（DTNB）与游离SH 反应，在波长412nm 处生成有最大吸收峰的黄色物质后，采用分光光度法进一步测定吸光度而得。实验还采用 NTSB 试剂在由亚硫酸钠存在的条件下与二硫键。反应是分两步的，首先是亚硫酸钠先使二硫键裂解，pH 值在 9 以上，反应是可逆的双分子反应，这就要求有过量的亚硫酸钠使二硫键迅速裂解。第二步反应就是巯基的亲核反应，即巯基与NTSB 的反应，生成一种黄色物质 NTB 和硫代磺酸盐。本实验采用这种方法对豆浆蛋白、牛奶蛋白、大豆粉蛋白中的二硫键进行了测定，都得到了较好的结果。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
大豆粉 安阳漫天雪蛋白有限公司；新鲜豆浆 市售；牛奶 上海光明乳液公司；尿素；EDTA;十二烷基硫酸钠；三（羟甲基）氨基甲烷；无水亚硫酸钠；浓盐酸。以上试剂均为分析纯。
缓冲液 A:8mol/L 尿素，3mmol/L EDTA,l%SDS 和0.2mol/L Tris-HC1（pH8.0）； 缓冲液B:10mmol/LDTNB,0.2mol/L Tris-HC1（pH8.0）； 缓冲液 C:8mol/L尿素，3mmol/L EDTA,l% SDS,0.1mol/L Na1.2 方法1.2.1 NTSB 的制备100mg的Ellment试剂溶解到10ml 1mol/L的亚硫酸钠中，在38℃下通入氧气直到亮红色溶液变成淡黄色，就表明 NTSB 已经生成。
1.2.2 豆浆中二硫键含量的测定方法对豆浆进行热处理：在带塞试管中进行热处理。试管中加入 20ml 豆浆，拧紧塞，置于 95℃的水浴中，处理时间为 90min.处理重复三次。
取样品4ml（1#）和2ml（2#）各一份，分别加入16ml和18ml 的丙酮，震荡后静置10min,再在 3000 ×g 条件下离心 15min,然后再用 10ml 的丙酮悬浮沉淀，再在3000 × g 条件下离心15min,重复两次。
用缓冲液A 20ml溶解一份处理过的豆浆（1#），缓冲液D 20ml 溶解另一份处理过的豆浆（2#），震荡并使其全溶。
取1# 溶液 0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5ml 于纸型管中，不同浓度分别测三次后取平均，在纸型管中分别加入0.1ml 的缓冲液B,震荡30min后加缓冲液A 稀释至3ml 再测吸光度。以加缓冲液B 而不加样品为空白。
取2# 溶液0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5ml 于纸型管中，不同浓度分别测三次，在纸型管中加入相同量的缓冲液 C 振荡30min 后加缓冲液 D 稀释至3ml 再测吸光度。以加缓冲液 C 而不加样品为空白。
1.2.3 牛奶中二硫键含量的测定方法直接取样品2ml 两份，分别加入18ml 的丙酮，振荡后静置10min,在 3000 × g 条件下离心 15min,然后再用 10ml 丙酮悬浮沉淀，再在 3000 × g 条件下离心1 5 m i n ,重复两次。其他操作同上。
1.2.4 大豆粉中二硫键含量的测定方法直接用缓冲液 A 20ml溶解0.1000g大豆粉（1#），缓冲液D 20ml溶解0.1000g大豆粉（2#），振荡并使其全溶。
其他操作同上。
1.2.5 巯基和二硫键含量计算公式在 pH8 的情况下，NTB 的摩尔消光系数是 13600/mol/L·cm.
SH（μmol/g） = （A412nm×D×10-6）/（C×V×13600）式中，A412nm为吸光度；D 为稀释倍数（对游离 SH,D=（3/所取样品溶液体积）×20;对总巯基D=（3/ 所取样品体积）× 20）；C 为豆浆固形物含量，25mg/ml;V 为所取豆浆或牛奶的体积 ml;SS（μmol/g）=总巯基含量
2 结果与分析
2.1 豆浆中二硫键含量的测定丙酮能将蛋白质沉淀分离，除去豆浆中的脂肪。
采用丙酮处理后，破坏了蛋白质与脂肪形成的乳化体系，使豆浆的混浊度大大下降，采用丙酮处理豆浆后既可测定豆浆中的游离巯基总量，又可测定蛋白质表面的游离巯基和埋藏在分子内部的巯基，丙酮处理可使蛋白质溶液的混浊度进一步降低，从而有利于巯基含量的测定。
在测定巯基时，人们还常常趋向于把蛋白质中游离的巯基（未形成二硫键的巯基）分为两部分：一部分是暴露在蛋白质表面的巯基，一部分是埋藏在分子内部的巯基。一般用标准缓冲溶液直接溶解蛋白质来测定前者，采用加变性剂如SDS、尿素的缓冲溶液溶解蛋白质测定巯基总量。
对热处理90min后的豆浆进行测定的结果见图。
2.2 牛奶中二硫键含量的测定牛奶也采用丙酮处理，牛奶和豆浆一样，混浊度都比较高，用分光光度计测定的时候会影响测定的准确性，采用丙酮处理后既可以出去牛奶中的脂肪，也可以降低牛奶蛋白质溶液的混浊度，有利于蛋白质表面的游离巯基和总巯基含量测定的准确性。由图5 可以看出，大豆粉中游离巯基的吸光度与所取样品的体积呈良好的线性关系，且线性回归后可得出y=0.3099x+0.0099,R2=0.9966.
由图可知，大豆粉中总巯基含量的吸光度与所取样品的体积呈正比的，且线性回归后可得出y=0.5624x-0.0068,R2=0.9988.
最后测得大豆粉中二硫键的含量为 4.877μmol/g.
3 结论
实验结果表明，分光光度法测定以上三种蛋白质中二硫键的含量，得到的巯基含量与吸光度呈良好的线性关系，说明此方法测定蛋白质中二硫键的含量可行，且此方法也比较简单、方便、准确、快速，可用于食品蛋白质中二硫键含量的测定，为测定蛋白质结构和性能的关系提供了参考。
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