动物细胞基因组DNA SNP的生物芯片检测-2
DNA (500 ng) is digested with Nsp I and Sty I restriction enzymes and
ligated to adaptors that recognize the cohesive 4 bp overhangs. All
fragments resulting from restriction enzyme digestion, regardless of
size, are substrates for adaptor ligation. A generic primer that
recognizes the adaptor sequence is used to amplify adaptor-ligated DNA
fragments. PCR conditions have been optimized to preferentially amplify
fragments in the 200 to 1,100 bp size range. PCR amplification products
for each restriction enzyme digest are combined and purified using
polystyrene beads. The amplified DNA is then fragmented, labeled and
hybridized to the array.
3、微点样法制备SNP检测DNA微阵列芯片
微点样法是制备DNA微阵列芯片的主要方法之一。该方法将事先设计并合成好的DNA探针通过点样仪（arrayer）按照一定的排列方式微量针点或喷点固定到固体基底表面，制备成DNA微阵列芯片（图27-4）。在芯片的制备过程中，基底材料的选择及其表面的化学修饰是至关重要的。许多材料都可以用作生物芯片的基底材料，如滤膜、玻璃片以及水凝胶膜。
3.1、载玻片及其氨基硅烷化修饰
由于玻片容易获得，具有本地荧光低、透明度高、热学性质好、硬度高、易于在表面进行化学修饰以固定核酸探针等特点，从而使之成为一种目前最为常用的生物芯片基底材料之一。此外载玻片表面光滑，而且没有多孔结构，标记的靶序列可以直接与固定探针结合，而不会受扩散效应的影响，具有较高的局部浓度和较快的杂交反应速度。这种没有多孔结构的表面也非常适合洗脱多于探针和非特异性吸附的标记靶标序列。大多数商品化的用于制备生物芯片的载玻片已经经过多聚赖氨酸、氨基硅烷或氨基修饰（图27-5）。尽管光滑无孔的载玻片在生物芯片应用中具有很多优点，但是这种载玻片在固定结构化生物分子，如抗体分子或结构化的寡核苷酸探针分子时很难保持其固有的分子结构；而且这种载玻片表面的固定能力有限，影响了检测灵敏度。
载玻片的氨基硅烷化及DNA固定原理如图27-5所示。氨基修饰氨基硅烷化基底需要使可逆的希夫碱（Schiff's base）还原成稳定的烷胺键化合物，图27-6为硼氢化钠还原步骤示意图。
3.2、载玻片上涂覆的水凝胶或聚合物膜：
为了解决平滑无孔载玻片的缺陷，将一种功能化的三维亲水多孔凝胶（如聚丙烯酰氨凝胶块）铺在载玻片表面，作为固定DNA分子的基底材料（图27-7）。多孔水凝胶材料结合
了平滑载玻片反应速度快和孔状材料可提供类似于液相的环境及较大的固定能力等优点。在这种基底上进行的杂交反应更接近于均一液相环境中的反应而不是固液界面的反应。而且这类多孔凝胶膜可在通用商品化的精密度较高的芯片点样仪和扫描仪上使用。这类水凝胶膜的缺陷是具有较高的荧光背景，反应完后需要经过长时间的清洗，才能除去表面非特异吸附的标记靶标；其次，在于液体接触时遇到较高杂交温度很容易破碎甚至溶解；最后，它的制备过程比较复杂，商品化的基片价格昂贵。
琼脂糖中邻近的羟基可在较为温和的条件下被高碘酸钠氧化，生成醛基。醛基可以与修饰了氨基的DNA分子探针反应形成希夫碱（图27-7）。
醛基可以与修饰了氨基的DNA分子探针反应形成希夫碱（Schiff's base）。
-
焦点事件
-
科技前沿
