我学者用CRISPR让猪生产人血白蛋白
在许多情况下，在大型家养动物中进行精确的基因组修饰，是可取的。在过去，这只能通过冗长而繁琐的克隆程序才能进行。近期，来自军事医学科学院放射与辐射医学研究所、第三军医大学、南京大学、国家蛋白质科学中心和广州医科大学附属第一医院的研究人员，通过使用最新的基因组编辑工具CRISPR/Cas9，将人血白蛋白cDNA敲入猪Alb基因位点，产生了重组人血清白蛋白（rHSA）。相关研究结果发表在最近的《Scientific Reports》。
国家“千人计划”获得者、北京蛋白质组研究中心副主任张普民教授和第三军医大学基础部实验动物学教研室主任魏泓教授，是本文共同通讯作者。南京大学模式动物研究中心的黄行许教授也是本文共同作者之一。
人血清白蛋白（HSA）是血浆中含量最丰富的蛋白质，在人体生理学中起着关键的调节作用，包括血浆胶体渗透压的维护、调节体液分布、小分子运输等等，是一些严重疾病（如肝功能衰竭和外伤性休克）的常规处方药。由于人类血液供应不足以及与人类血液相关的风险，科学家们一直都在寻求人血清蛋白的替代生产。
之前，有科学家以Albumin-GFP融合的形式进行显性转基因表达，在猪中生产出了重组HSA。然而，在转基因的方法当中，由于存在内源性的猪白蛋白，因此，rHSA的分离和纯化都是有疑问的。
在这项研究中，研究人员利用CRISPR/Cas9系统在基因组修饰中的力量，通过将人血清白蛋白cDNA敲入猪的白蛋白基因位点，在猪当中生产重组人血清白蛋白。
通过将人ALB cDNA加SV40 polyA信号序列（总长2368bp），注入猪Alb位点下游起始密码子，研究人员希望人类ALB能在猪内源性白蛋白基因的转录调控下表达，同时阻止猪内源性白蛋白的表达。研究人员设计了一个sgRNA靶定起始密码子区域，并生成一段目标片段（同源重组的供体），在两侧插入1
kb的同源序列。
因为用于供体的5′同源序列达到了起始密码子，它包含sgRNA序列，从而可以在同源重组后被sgRNA靶定作为供体或敲入基因。为了防止这种情况发生，研究人员在起始密码子之前向sgRNA序列中插入了6
bp（gccacc）。sgRNA是在体外转录、纯化，并连同Cas9 mRNA和包含靶片段的循环载体，一起注入受精卵。卵母细胞的来源是巴马小型猪。在植入发情期的同步雌性猪之前，注射的胚胎被培养了1到2
小时。约300只胚胎被植入10名雌性猪体内，其中5只猪怀孕，并产下了16只活的幼崽。幼崽在标准的照顾下，并没有出现任何不寻常健康问题的迹象。
经过基因型分析，研究人员发现，16只猪仔携带了预期的敲入基因，这些猪仔血液中存在人血清蛋白。此外，这个敲入的等位基因被成功地传递给后代。精密基因组工程的这一成功，有望促进科学家探索猪和其他大型家养动物，用以生产生物医学产品，或选育具有更理想性状的家畜品种。
