影响3730测序质量的有哪些因素？
答：
(1) DNA模板问题（关键因素）
(a) 非特异PCR产物
现象：每个峰下面都有其他颜色。
原因：PCR主带与杂带混在一起测序。
对策：凝胶电泳回收主带，重新测序。
(b) 非单克隆
现象：左边清晰干净；右边全部双峰，且信号强度比左边低一倍。
原因：挑克隆时，两个不同的菌落混在一起。
对策：重新挑单克隆，重新提取质粒。
(2) 引物问题
(a) 引物碱基问题
现象a：每个峰后面有个同样荧光信号的小“尾巴”。
原因：合成时，引物多了一个碱基。
对策：重新合成引物。
现象b:每个峰前面有个同样荧光信号的小“尾巴”。
原因：合成时引物多了一个碱基。
对策：重新合成引物。
现象a 现象b
(b) 引物模板不纯
现象：整个峰图噪音都比较高。（区别与小片段的干扰）
原因：引物（模板）纯度太低，含有较多杂质
对策：
–建议使用HPLC（柱子纯化）或PAGE 纯化的测序引物。
–脱盐纯化的引物纯度较低，适合做普通PCR，但不建议用来测序。
(c) 引物二聚体
现象：前面100多bp噪音高，后面正常
原因：引物二聚体未去除干净
对策：–割胶纯化
(3) 纯化影响
(a) 轻微的荧光污染
现象：红色峰异常高
原因：未知大分子荧光物质污染，恰好是红色，被软件误认为红色峰。
对策：依次更换水、缓冲液、甲酰胺、测序胶、毛细管；清洗或更换胶引导块、针筒。
(b) 钉子峰
现象：四色并存突然拔起的尖峰，峰形锐利。
原因：毛细管内有气泡、灰尘、尿素结晶等，对激光全反射。
对策：–灌胶时，避免气泡产生；
–上样前，样品先离心；
–毛细管、检测窗口保持清洁；
–胶内有尿素结晶时，注意不要吸进注射器；
–样品纯化干净。
(c) 瀑布效应
现象：–基线从高处突然下降。
原因：–有机物进入毛细管，受激发产生一定波长的荧光，抬高基线。
对策：–依次更换水、缓冲液、甲酰胺、测序胶、毛细管；清洗或更换胶引导块、针筒。
(4) 毛细管寿命与电泳
现象：宽峰-测序峰逐渐变宽。
原因：–样品进入毛细管太多。
对策：–稀释样品浓度，重新进样。
–减少电进样(EKI)时间。
