Orbitrap质谱蛋白质组沙龙在京举行
【导语】使用质谱仪器进行蛋白质组研究中有三个关键环节，第一个是样品的处理阶段，这是最简单，也是最重要的一个步骤。第二个阶段是仪器的操作部分，使用液相、质谱等仪器把蛋白质进行分离、分析。主要涉及仪器参数的优化调整。第三步是生物信息学分析部分，这也是最难的部分。本期沙龙中中科院生物物理所的薛鹏老师和医科院基础所的孙伟老师分别从样品制备环节和仪器参数调整两个方面介绍了工作中的一些经验。
2012年4月21日，由中国医学科学院基础医学研究所、赛默飞世尔科技、分析测试百科网共同发起、策划，组织的蛋白质组学沙龙在中国医学科学院基础医学研究所老楼外宾室举行。本次沙龙主要围绕蛋白质组领域，来自中国科学院系统、国家食品安全风险评估中心、北京出入境检验检疫局、军事医学科学院等一线科研人员、以及赛默飞世尔科技的技术工程师近30人参加了本次沙龙活动。
沙龙现场
中国医学科学院基础医学研究所中心实验室的孙伟老师首先介绍了本期沙龙举办的情况。孙老师讲到，之前AB SCIEX公司和二炮医院一起组织了一个质谱沙龙，主要关注研究小分子的药物和代谢领域。中国医学科学院基础医学研究所和赛默飞世尔科技合办的质谱沙龙主要关注蛋白质组领域。目前在蛋白质组研究领域中召开的很多会议，报告很少涉及仪器使用和应用。建立这个质谱沙龙的初衷就是为从事质谱工作的一线实验人员提供一个平台，可以共同交流讨论操作仪器的问题和经验。给大家工作中有所提示，达到相互借鉴的目的。本次沙龙主要围绕蛋白质组研究，今后还有食品和农业领域、最新仪器/技术、药物研发及检测方面的多期沙龙活动。孙老师欢迎大家今后多多参与，共同讨论质谱仪器研究中的问题和心得。
在使用质谱仪器进行蛋白质组研究中有三个关键环节，第一个是样品的处理阶段，这是最简单，也是最重要的一个步骤。第二个阶段是仪器的操作部分，使用液相、质谱等仪器把蛋白质进行分离、分析。主要涉及仪器参数的优化调整，第三步是生物信息学分析部分，这也是最难的部分。本期沙龙中中科院生物物理所的薛鹏老师和医科院基础所的孙伟老师分别从样品制备环节和仪器参数调整两个方面介绍了工作中的一些经验。
中科院生物物理所 薛鹏老师
薛鹏老师带来的报告题目是《超滤辅助的顺序酶切样品制备方法》。
薛鹏老师来自中科院蛋白质组学技术实验室，为中科院生物物理研究所和北京生命科学大型仪器区域中心管理委员会下属众多实验室之一。实验室成立于2004年，历经一期建设、二期建设。目前实验室拥有双向电泳系统、Typhoon scanner、LTQ LC/MS、MALDI TOF、全自动斑点处理工作站、Sequest cluster等仪器，二期建设后增加一些高性能的仪器，有TSQ vantage LC/MS、LTQ Orbitrap XL LC/MS、6460 Triple Quad LC/MS、6530 Q-TOF LC/MS、PA 800plus毛细管电泳、6110 Single Quadrupole LC/MS。实验中心有完善的仪器管理系统，用户流程和操作员流程简单明了。主机房中前兆交换机保证了信息化系统的安全快速。薛鹏老师所在的蛋白质组学技术实验室不仅拥有多台大型仪器，同时实验室还根据实验需要自主开发和改进仪器。比如高灵敏度高通量和高效多维蛋白质鉴定系统SCX-C18，自主填料的nano色谱柱，填料到达了柱子尖端减少了检测器的扩散。
薛老师介绍了他近期的工作：超滤辅助的顺序酶切样品制备方法。这是因为orbitrap多肽鉴定的分子量分布与实际酶切多肽分子量分布的不一致。这和质谱的灵敏度和结果检索算法的特性有关。实际中可以检测的分子量范围位于700-3000。为了提高灵敏度，增加检测的蛋白质数量，实验中要使用酶切的方法。基本想法是低端的使用一个长的酶切变成一个高的分子量后分离检索，高端的使用另一个酶切变成低分子量来检索。薛老师设计的超滤辅助顺序酶切的基本技术路线就是使用膜过滤的三步酶切法：样品使用Lus-c酶切上质谱，过膜后用Trupsin酶切再上质谱，过膜后第三步使用GLU-C酶切上质谱。对比实验中直接使用Trupsin酶切三遍不过膜直接上质谱。
三步酶切法
对比实验
在检测中，薛老师也进行了一些改进，在长分析柱的一维LC/MS检测中，分析柱的内径从100u改为75u，长度由10cm增加到20cm;流速从500nl降到300nl;TRAP柱放在分析柱前，减少和分析柱之间死体积。在多维检测中，除了分析柱内径和长度、泵的流速同样变化外，同时新增自动进样器进样功能使用两个切换阀，为了保持盐洗脱时SCX柱的最佳流速1-1.2ul，使用了5cm长度的C18trap柱。实验结束可以看到，使用顺序酶切后获得的蛋白有6357，而Trupsin3次重复酶切只得到5950个蛋白。在多维检测中，顺序酶切多肽数目达到47257，三次Trupsin酶切得到35135个，数量差别就比较大。
把超滤辅助的顺序酶切方法用于磷酸化组学中，使用LysC、Trypsin、GluC酶切可以得到总的磷酸化位点达到4000多个。因此薛老师认为超滤辅助的顺序酶切蛋白质组学样品制备方法能有效提高蛋白质组和磷酸化蛋白质组的覆盖率。
最后薛老师和大家分享了磷酸化实验MSA的一些经验。
医科院基础所 孙伟老师
孙伟老师报告的题目是《Orbitrap高分辨质谱仪在尿蛋白质组上的应用》。孙老师首先介绍了医科院基础所质谱中心的发展历史。2002年到2006年，医科院基础所的蛋白质组学中心建在亦庄，是国内研究蛋白质组比较早的实验室，当时实验中心的质谱仪器只有赛默飞世尔科技的一台LCQ DECA XP+和一台AB SCIEX的Voyanger。2007年搬到了现在的东单医科院基础所的质谱中心，目前已经拥有4台质谱仪和5台液相色谱，有赛默飞世尔科技的LTQ XL和LTQ Orbitrap Velos，布鲁克公司的UltraflexExtreme MALDI TOF/TOF，AB SCIEX 公司的5600 Triple TOF等。质谱中心主要从事蛋白质组方面的研究，除了自身科研外，也为医科院和外部实验室科学研究提供平台进行检测和方法开发。
孙伟老师介绍来了LTQ Velos Orbitrap中比较重要的是s-lens设计、双压离子阱设计。S-lens双内径可变间距透镜传输系统，增加离子聚焦功能，离子强度比XL要增加一个数量级，灵敏度高;2个离子阱明显增加扫描速度。2009年Olsen发表论文：LTQ Orbitrap Velos和LTQ Orbitrap XL进行BSA肽鉴定比较，Velos鉴定结果比XL好，浓度越高，差别越小，当BSA浓度很低时，XL鉴定出的肽数量和Velos差距很大。
随后孙老师从自身工作出发，介绍了购买仪器后，前期所做的优化和测试。主要包括动态排除，电荷状态，MS/MS数目，分辨率，窗口宽度，污染。
动态排除是鉴定过程常用的一个方法。在1个小时的梯度时间内，把动态排除时间分别设置不同数值，测试可鉴定出的蛋白数量，实验结果显示15s时鉴定出的蛋白数量最多，可以得到的谱图数和总谱图数也是最多的，谱图的利用率也很高。因此试验中设定动态排除时间为15s。孙老师强调动态排除时间和半峰宽有关，因此实际工作中需要考虑色谱和样品的因素。
Orbitrap仪器可以测出电荷状态，因此电荷状态的设定也是一个因素，样品处理情况和后期的结果处理软件也影响到电荷状态。肽一般带两个电荷，考虑现在的生物学信息软件也不合适分析高电荷，试验中一般设定2个电荷。
做一级质谱分析的时候，仪器使用不同分辨率鉴定出的蛋白质没有很大差别。实验中一般选择分辨率30000。做二级质谱分析时，窗口宽度一般需要设定，会对结果产生一定影响。使用一个标准品从1-5分别设定进行实验，一般使用2.5。但在复杂样品分析时，窗口放宽会出现共洗脱峰出现。
孙老师重点介绍了污染的影响，Orbitrap由于s-lens设计使得进入四级杆的离子数量增多，灵敏度增加，但同时也增加了污染的机会。所以孙老师建议出现污染后需要把s-lens、四级杆都清洗一遍。
目前国外实验室经常有实验室对比，孙老师也希望大家能够使用同一样品在不同的仪器平台上进行对比，比较结果希望对应用有所帮助，对今后的实验有所借鉴。
最后大家一起参观了医科院基础所的质谱中心实验室。
Orbitrap质谱蛋白质组沙龙与会者合影
医科院基础所质谱中心实验室仪器
