凋亡聚焦：选择合适的TUNEL分析
DNA 片段化是凋亡的一个重要特点。提起DNA片段化的检测，大家自然会联想到TUNEL。TUNEL的全称为Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，即脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)介导的缺口末端标记法。1992年，三名以色列科学家在JCB杂志上首次提出了片段化DNA的原位检测方法，但这种方法饱受争议，因为它无法区分凋亡细胞和坏死细胞。几年后，方法经过改进，演化成现在的TUNEL分析。也就是说，TUNEL分析已经有整整20年的历史了。
TUNEL技术的原理是染色体DNA断裂时产生大量的粘性3"-OH末端，而生物素或荧光素标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下掺入到DNA的3"-末端，并通过一定的显色系统使之显示出来。这种方法较电泳法来说更为灵敏，荧光显微镜能检测到单个细胞，流式细胞仪也能检测约100个细胞。市场上的TUNEL分析有很多种，究竟如何选择，且听本文分解。
考虑您的样品类型
您首先要考虑的是哪个TUNEL分析最适合您的样品类型。一些厂家为不同的样品类型提供预先优化的试剂盒。例如，BioVision提供了适用于细胞、组织、切片及FFPE样品的试剂盒：ApoBrdU™ DNA Fragmentation Assay Kit、ApoBrdU Red™ DNA Fragmentation Kit、ApoBrdU-IHC™ DNA Fragmentation Assay Kit和ApoDIRECT™ DNA Fragmentation Assay Kit。所有试剂盒都提供了完整的组分，包括阳性对照和阴性对照细胞或玻片，便于DNA片段化的检测。
ApoBrdU 分析采用两色的TUNEL方法，以检测凋亡细胞的DNA链断裂。ApoBrdU Red采用相同原理，但是为包含GFP的细胞设计的。ApoBrdU-IHC™则顾名思义，适合免疫组化分析。ApoDIRECT™分析则提供了凋亡细胞的一步标记，适合流式分析。
在处理组织时，专门的试剂盒可能更为有用，因为组织类型通常变化很大。体内的每种组织都有其独特的结构和物理特性，这与其特定功能相关。因此，不同的组织需要不同的制备条件，以便随后的生物学分析。为此，美国Trevigen提供了多种组织特异的试剂盒，包含了专为特定组织类型而优化的试剂和操作步骤，如适用于神经组织的NeuroTACS™、心肌组织的CardioTACS™、血管组织的VasoTACS™、肿瘤组织的TumorTACS™和皮肤组织的DermaTACS™。通过透化试剂的选择和阳离子系统的优化，提高了检测系统的敏感性，降低了背景和坏死细胞的着色，也大大节省了客户优化操作的时间。目前这一系列产品也可通过R&D Systems购买，索取资料。
考虑通透性和标记
试剂的膜通透性和缺口DNA的标记，也是值得考虑的因素。过去，分析中的dUTP通常是经过生物素或荧光素标记，但最近几年，多个厂家都推出了升级产品。他们以Br-dUTP来取代生物素或荧光素标记的dUTP，在TdT酶的作用下掺入到凋亡DNA片段的3"-末端。因为溴分子比荧光素、生物素或地高辛标记等标记物要小得多，因此Br-dUTP更容易掺入凋亡细胞的DNA片断中，而最后的检测信号也更强。
这一系列的代表产品有：默克密理博的 Apo-BrdU™ Kit、Life Technologies的APO-BrdU™ TUNEL Assay Kit、BD的Apoptosis Detection Kit (APO-BRDU)，以及Sigma-Aldrich的APO-BRDU™ Kit等。除了Life Tech的产品采用Alexa Fluor® 488标记的BrdU抗体外，其他试剂盒均采用FITC标记的抗体。这些产品的规格均为60次检测，价格在6000-9000元不等。
此外，Life Tech还独家推出了一款Click-iT® TUNEL Assay。它采用经过炔烃修饰的dUTP，比Br-dUTP更小，因此更容易被TdT掺入。而检测也不是基于BrdU与抗体之间的反应，而是基于点击(Click)反应，一种铜催化的叠氮化物与炔烃之间的反应。与BrdU抗体(分子量约为150 kDa)相比，Alexa Fluor® 叠氮化物的大小仅为1%(分子量<~1000 Da)。因此只需要使用温和的固定和透化条件，即可实现试剂的渗透。
据Life Tech介绍，与其他方法相比，Click-iT® TUNEL Assay在相同条件下能够检测更高比例的凋亡细胞。整个过程也很快，大约在3小时内完成。Click-iT® TUNEL Assay提供三种不同的荧光染料：Alexa Fluor® 488(绿色)、Alexa Fluor® 597(橙色)和Alexa Fluor® 647(红色)。此试剂盒足够开展1x96次检测或50块盖玻片，价格为9820元。
