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质谱沙龙第三十四期活动报道

2011.12.07

  2011年12月4日,第三十四期质谱沙龙活动在第二炮兵总医院药学部成功举行。本次沙龙探讨了质谱技术在临床药物监测(TDM)和食品中过敏原物质检测方面的应用,并有华质泰科(ASPEC)公司首席技术官刘春胜博士为大家带来了国际前沿的液滴萃取表面分析(LESA)技术及其应用。来自第二炮兵总医院、北京安定医院、中科院高能所、中国计量科学研究院、中国环境科学研究院、北京师范大学医院、AB SCIEX公司、华质泰科生物技术(北京)有限公司、北京艾米诺医学研究有限公司等,二十余位专家、学者、技术工程师参加了本次沙龙活动。

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第三十四期质谱沙龙活动现场

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第三十四期质谱沙龙活动现场

质谱检测技术在临床治疗药物监测(TDM)中的实际应用

  第二炮兵总医院李鹏飞老师作了题为《质谱检测技术在临床治疗药物监测(TDM)中的实际应用》的报告,介绍了临床治疗药物监测(TDM)的概念方法,他克莫司及试剂盒开发、环孢素TDM工作、免疫抑制剂及其合并用药、以及中毒检测和内源性小分子等相关研究工作,并简要介绍了所在实验室的质谱检测平台、科研工作和科研活动。

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第二炮兵总医院 李鹏飞 老师

  治疗药物监测(TDM)介绍

  治疗药物监测(“血液浓度监测”TDM)是对治疗指数窄、毒性作用强、个体差异大的药物,测定其血液或其他体液中的药物浓度,根据药动力学原理制定个体给药方案。按照“医院管理评价标准”的规定,医院应当开展治疗药物监测,推广个体化给药方案。传统的治疗方法是参照教科书上推荐的平均剂量给药,其结果是仅一些患者得到有效治疗,另一些则未能达到预期的疗效,甚至出现了毒性反应。TDM药物具有明显的特点:安全范围窄,治疗浓度范围与中毒浓度很接近,如地高辛;无明显的、可观察的治疗终点或指标,无及时的、易观察的、可预知疗效的临床指标,如抗癫痫药物;剂量、药物作用之间的关系不可知,同一剂量,不同患者可出现有效、无效、中毒等不同反应,如苯妥英钠;药物中毒与无效时均危险,如抗排异药物;药物血液浓度与临床作用、中毒之间有一个较好的关系。目前临床主要监测的品种有庆大霉素、万古霉素、环孢霉素A、卡马西平、地高辛、丙吡胺等。

  国内治疗药物监测主要光谱法、免疫法、色谱法等。光谱法一般有比色法、紫外分光光度法、荧光法等,灵敏度比较低,只能监测体液中药物浓度在1.0µg/mL以上,并且代谢物或结构相近化合物对监测的干扰较大,该法基本淘汰。免疫法利用蛋白竞争的原理进行监测,放射免疫法、酶免疫法、荧光免疫法、均相酶免疫法等,方法样品处理简单,获取结果时间较短,已成为临床用于评判疗效的一个重要依据,是国内临床通用方法。色谱法有HPLC法、气相色谱、高效毛细管电泳法、LC-MS法等,具有高通量、高灵敏度、高特异性等特点,检测值更接近真实值,国外广泛使用。LC-MS/MS进行TDM具有快速、多组分同时测定,专属性强、灵敏性和准确度高、重现性好,性价比高等优势。患者能够获得安全有效的治疗,达到器官移植的最终目标,降低急性排斥反应发生率和感染风险,而且检测及药品费用降低;医生可以得到准确的检测结果,做出高效安全的治疗方案,提高了病床周转;医保部门也可以多方位节约成本,如检测费用和治疗费用;医院也可节省医疗资源,增加学术和经济收益,提升市场竞争力。

  李老师对TDM市场作了简要分析,以监测他克莫司为例。全国约有1.5万移植患者,每例移植患者每年监测20次,监测市场9000万元,LC-MS占市场的1/5,约2000万元。快速、准确的治疗药物监测结果是“以病人为中心”临床个体化工作的需要,也是提升医药水平市场竞争力的需求。随着分析技术的不断发展,LC-MS/MS法将逐渐取代免疫分析技术成为TDM的常规方法。它的低成本、高准确度将是患者以及医疗人员的福音。

  相关研究工作

  他克莫司监测起源于生物等效性试验研究,由于免疫法检测费用高、灵敏度低,而且血药浓度个体差异大,所以李老师采用了液质联用技术,并于2007年申请了《药物代谢酶基因多态性和LC-MS/MS技术联合指导他克莫司个体化给药临床应用》的课题,得到了首都医学发展基金的支持,该课题建立了LC-MS/MS方法监测血液浓度,研究了基因多态性。液质参数如下表,样品前处理流程见下图。

  色谱柱  Shim-pack VP-ODS柱
  流动相  乙腈-10mmol·L-1乙酸铵梯度洗脱
  流速  1.0mL·min-1
  柱温  50℃
  进样量  20µL
  离子源  离子喷雾离子化源(ESI)正离子方式检测
  扫描方式  多重反应监测(MRM)
  DP电压  60V
  CE电压  21eV

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样品前处理流程

  李老师采用LC-MS/MS法测定他克莫司,考察了其专属性、准确度、精密度、线性和定量限结果,相对标准误差在10%以内,线性范围为0.5-50ng/mL(MEIA法1-30ng/mL),相关系数都接近3个9,检测限为0.05ng/mL,灵敏度高,线性好。另外,李老师考察了LC-MS/MS法与MEIA法测定肝移植患者全血样品结果,共8个试验批次,800多个样本,得到了很好的相关性,而后又做了9个试验批次。对74例健康者进行分析,FK506的主要代谢酶是细胞色素CYP3A5,中国人群的基因背景与白种人和黑人有很大的差异。该方法是创新的检测方法,用于他克莫司的LC-MS/MS法检测试剂盒是SFDA第一个批准的,是全国第二个获批的LC-MS/MS试剂盒产品,批准文号是京药监械(准)字2009第2400778号。

  对于环孢素的研究,李老师采用了HPLC-MS/MS分析法、TDx分析法和蛋白沉淀板法。HPLC-MS/MS分析法是精密取50µL全血样本,置于1.5mL EP管中,加入50µL红细胞破碎剂,200µL内标CsD,涡旋2min,13200r/min离心5min,取上清液,进样20µL,进行HPLC-MS/MS分析,得出结果需3min,检出限10ng/mL。TDx分析法取全血样本150µL,加入红细胞破碎剂50µL,混匀,再加300µL蛋白沉淀剂混匀,离心5min,取上清液150µL,置TDx仪内测定,得出结果约需15min,检出限100ng/mL。蛋白板沉淀法是将HPLC-MS/MS分析法上清液通过蛋白沉淀板处理,抽滤后再加入600µL乙腈冲洗药物。取上清液,进样20µL,进行HPLC-MS/MS分析,得出结论需3min,检出限10ng/mL。然后,对TDx和HPLC-MS/MS进行相关性分析,并比较HPLC-MS/MS法和TDx分析法测定全血中环孢素A批次-浓度曲线图,以及比较MAS沉淀板与蛋白沉淀质谱法测定全血中环孢素A曲线图。李老师得出结论,HPLC-MS/MS分析方法测定浓度值/TDx法测定浓度值平均值为(54.8±7.35)%,中国人群比值首次被我们提出并用于TDx法推测HPLC-MS/MS法治疗窗。MAS沉淀板法使细胞中的药物释放出来,并且样品处理更干净,浓度升高,跟TDx检测浓度具有很好的相关性,具有较高相关系数和统计学意义。

  接下来,李老师简要介绍了免疫抑制剂及其合并用药,并讲了一些中毒检测、内源性小分子检测等拓展工作。中毒筛查发生情况统计显示3、5~7、11~12月为高发期,且以女性为主,比例约是男性的2倍。检出药物累计总数277个,计91种,根据统计,应加强艾司唑仑、地西泮、咖啡因等药品的管理和流通,防止用药过量和自杀性用药。李老师所在实验室08年与国外实验室交流与技术共享,成功建立了定量检测人体内42种氨基酸的标准方法。现初步建立起适用于中国人群的正常血氨基酸水平,可明确地根据直观图表,判断体内的氨基酸平,提供个体的营养、代谢、健康状况,并提供相应的改善意见。

  实验室情况

  李老师所在实验室的质谱检测平台,在2006年3月安装了3200 QTRAP型液相色谱仪,并在2009年3月买了第二台质谱仪,同时还配备了氮吹仪、固相萃取仪、高精度天平、高速离心机等,进一步完善了该平台。质谱检测技术平台的功能包括中毒药物快速筛查(全国首家),体内药物分析测试平台,I期新药试验测试平台和体内生物小分子定量分析(全谱氨基酸、新筛)等。目前,实验室已完成30余项新药I期药代动力学研究的检测项目;开展了LC-MS/MS高通量筛查和评估人体内火箭推进剂中毒水平的研究;开展特色临床检测:全谱氨基酸检测,中毒药物检测,他克莫司检测(国内第二个LC-MS/MS试剂盒);参与多项对外检测服务;现在正在进行氯吡格雷和雷奈酸锶-雷奈酸的药代动力学研究。实验室科研活动丰富多彩,参加了诸多学术会议,对内部员工进行了专业培训,还成功举办了34期质谱沙龙活动,40余单位150余朋友参加,为质谱一线技术人员提供了活跃的交流平台。

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