利用大肠杆菌可生产糖基化的重组异源蛋白

虽然大肠杆菌表达载体可以用来生产生物药物，但是由于临床上约70%的治疗用蛋白属于糖基化修饰型蛋白，而大肠杆菌细胞缺乏蛋白质糖基化修饰系统，所以限制了其应用。自从有研究者将空肠弯曲杆菌的N-糖基化修饰机器导入大肠杆菌获得成功后，利用大肠杆菌生产糖基化的重组异源蛋白已经成为可能。大肠杆菌表达系统作为最常用的表达系统，含有很多优势，该系统也毫无疑问地包含在蛋白表达外包公司提供的技术服务中。

糖基化作为一种重要的修饰，广泛存在于细胞中，影响细胞的生命活动。这种修饰的具体过程就是将糖供体以糖苷键的形式连接到蛋白质、脂质或其他分子上的过程。糖苷键即指糖的羟基与其他物质之间缩合而形成的化学键。其中，蛋白质糖基化修饰通常涉及糖的羟基共价结合到丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸等的基团上，此过程主要发生在内质网系统的高尔基体内。美迪西提供蛋白表达外包服务，拥有多种蛋白表达系统，包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统（杆状病毒）和哺乳动物细胞蛋白表达系统，具备多种融合技术，可以为客户在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。

蛋白质的N-连接糖基化是真核生物中最重要的翻译后修饰方式之一，研究者发现在微生物的空肠弯曲菌含有pgl基因簇，这一基因簇在各种糖蛋白的合成中会设计到。通过向大肠杆菌中成功转入pgl途径，大肠杆菌中可以生产各种糖基化蛋白。在大肠杆菌表达系统中进行重组异源蛋白的糖基化修饰需要注意：

1、降低细菌寡糖基转移酶的底物特异性

大肠杆菌虽然不含复杂糖链的合成机器，却拥有O-抗原（由3~6个单糖构成的寡糖链）连接酶WaaL，后者能将O-抗原交联在脂质A上，任何在大肠杆菌中表达的异源寡糖链均可被WaaL 交联至脂质但非目标蛋白中^[1]。因此，大肠杆菌异源蛋白糖基化能力工程化设计和引入的第一步是构建基因型为ΔwaaL的缺失突变株，如源自大肠杆菌W3110株的CLM24突变株。

空肠弯曲杆菌的蛋白质寡糖基转移酶PglB能在周质环境中将寡糖链位点特异性地交联在原核细菌内源性蛋白或重组异源蛋白多肽链中D/E-X1-N-X2-S/T（X 为Pro除外的所有氨基酸）保守序列的天冬酰胺残基上，但绝大多数来自真核生物的异源蛋白糖基化位点序列往往不含带负电荷的D或E残基。由于目标蛋白的氨基酸序列一般不允许改变，因此需要通过改造PglB的结构特征以拓宽其对蛋白底物的识别特异性。事实上，D或E的存在并非PglB介导寡糖链交联所必需，但对酶促反应效率影响很大。PglB的晶体结构已提示改变其底物识别特异性或提高酶催化活性的关键氨基酸位点，但基于点突变的PglB改造效果并不理想，在大肠杆菌中PglB介导真核型寡糖链转移的效率仅为1%；在原核细菌范围内进一步搜寻具有较低底物糖基化位点特异性的PglB同源物有可能最终解决这一问题。

2、引入真核生物糖链合成的机器

大肠杆菌天然存在十一异戊烯焦磷酸-α-N-乙酰葡萄糖胺-１-磷酸转移酶（WecA），它能将N-乙酰葡萄糖胺-１-磷酸转移至定位于内膜胞质一侧的原核细菌特征性寡糖链合成载体十一异戊烯焦磷酸(Und-PP)上。研究显示，在ΔwaaL型大肠杆菌CLM24缺失突变株中分别导入来自酿酒酵母的异源二聚体型β-１，4-N-乙酰葡萄糖胺转移酶（Alg13/Alg14）、β-甘露糖转移酶（Alg1）、双功能型α-１，3- 甘露糖和α-1，6- 甘露糖转移酶（Alg2）以及空肠弯曲杆菌的PglB编码基因，便能使大肠杆菌产生含类似真核生物寡糖侧链Man3GlcNac2的重组糖蛋白。这种经工程化改造的大肠杆菌首先在其内膜胞质一侧合成Man3GlcNac2寡糖单位，再借助其自身存在的O-抗原翻转酶（Wzx）将之翻转至周质一侧，最后由PglB交联至重组异源蛋白的相应糖基化位点上。

然而，人体内天然糖蛋白的糖链结构还含有N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖、唾液酸的延伸单位，上述构建的大肠杆菌工程株距最终表达人源化糖蛋白产物的目标还有较长的路。此外，这一策略要求重组异源蛋白能分泌至大肠杆菌的周质中，因而表达量往往受到很大程度上的限制。

3、提升糖基化重组异源蛋白的表达效率

限制大肠杆菌高效表达糖基化重组异源蛋白的因素很多。首先是，PglB的寡糖链转移效率具有较大的改进空间，采用密码子优化等策略可使PglB在大肠杆菌中的寡糖链转移效率提升至77%。其次减小大肠杆菌的代谢负荷被证明能有效提高重组异源蛋白的糖基化效能，提升磷酸烯醇丙酮酸依赖型单糖磷酸转移系统的效率有助于打通重组大肠杆菌的代谢瓶颈。例如，ptsA基因的过表达能使多种重组异源糖蛋白的表达量提高6.7倍，达到大约9mg/L的水平；参与寡糖链装配的异柠檬酸裂解酶的过表达也能使重组异源糖蛋白的表达量提高3倍。

把空肠弯曲酶的糖基化途径转入大肠杆菌的分子工程为在大肠杆菌中表达糖蛋白铺平了道路。正N-糖基化修饰是改善药物蛋白理化性质、改善药代动力学特性、提高药效的重要方法。应用大肠杆菌表达N-糖基化蛋白可获得均质性糖蛋白,其相关研究已成为糖工程领域研究热点之一。现在利用空肠弯曲杆菌N-连接糖基化体系生产出了能够同时针对革兰氏阴性和阳性病原体的糖缀合物疫苗。

[1]基因工程[M].