DC-CIK细胞制备方法（二）
1．外周血单个核细胞的采集
1.1 用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80 - 100ml；
1.2 淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；
1.3 无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC，细胞数量需达到1-3 x 108。
2．(可选步骤)肿瘤抗原的制备]
用于负载DC的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigens, TAA)，也可以是肿瘤全细胞抗原。
用TSA或TAA负载的DC具有很好可克服这些缺陷，因为此时无需知道那些抗原是肿瘤细胞的TSA或TAA，而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击DC可诱导产生针对不同抗原决定簇的细胞毒T淋巴细胞(CTL)克隆，从而实现对肿瘤细胞的有效杀伤。
肿瘤细胞全抗原负载DC的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载DC、用凋亡肿瘤细胞负载DC、用坏死或死亡的肿瘤细胞负载DC，用肿瘤活细胞负载DC，和将肿瘤细胞与DC融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞裂解液负载DC，因该方法简单、快速、有效。
反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：
2.1 手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；
2.2 无菌生理盐水洗3次；
2.3 用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640培养基，充分研磨；
2.4 200目无菌网过滤后收集单细胞悬液；
2.5 用RPMI 1640培养基重悬细胞至1-2 x 107/ml，装入5ml无菌冻存管中；
2.6 将冻存管浸入液氮中速冻，10 min后取出，再迅速放入37℃水浴中解冻10 min。反复3-5次；
注：也可以-80℃/37℃反复冻融3-5次。
2.7 将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min；
2.8 收取上清，0.22μm滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；
2.9 -80℃保存备用。
3.0 CIK细胞的培养及鉴定
3.1 步骤1中获得的PBMC 用无血清培养液调整细胞浓度至2 x 106/ml，置于培养瓶内；
3.2 37℃，5%CO2培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁；
3.3 收集悬浮细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至1-2 x 106/ml；
3.4 加入1,000 U/ml 的重组人IFN-γ培养；
3.5 24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；
注：此时也可同时加入100U/ml的重组人IL-1a。
3.6 每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2300 U/ml；
3.7 在培养的第7d，收获CIK细胞,此时数量应达到1x109个以上；
3.8 CIK细胞质控：
3.8 .1台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
3.8 .2用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8和CD56 等分子的表达，观察CD3+CD56+细胞的比例是否明显提高。
4.DC细胞的培养及鉴定
4.1 步骤3.2中剩下的贴壁细胞(主要是CD14+的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1,000U/ml和重组人IL-4 500U/ml的无血清培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；
4.2 每3d 半量换液一次，并补足细胞因子；
4.3 (可选步骤)?在培养的第5d, 加入步骤2中获得的肿瘤抗原50 mg/ml，对DC进行抗原负载；
注：若不对?DC?进行抗原负载，该步省略。
4.4 在培养的第6d，加入重组人TNF-α(500U/ml)，诱导DC细胞成熟；
4.5 在培养的第7d或第8d，收获DC 细胞，其数量应达到1×106个以上；
4.6 DC的质检：
4.6 .1台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
4.6 .2流式细胞仪检测DC 细胞表面HLA-DR、CD83 和CD86 等分子的表达以确定DC是否成熟。
