免疫细胞治疗DC-CIK细胞的制备方法及SAFIRE功能性...（二）
IL-2 (白细胞介素-2)
IL-2 最初发现时被称为T 细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T 细胞
增殖最重要的细胞因子。IL-2 既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T
细胞表面的IL-2 受体(IL-2R)的特异性结合而促使T 细胞活化，并进入细胞分裂状态。
此外，IL-2 还可刺激NK 细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK 细胞培养中须添加
IL-2，以促进T 细胞的增殖与活化。
IFN-γ (干扰素-γ)
IFN-γ 具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促
增殖反应的敏感度和强度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN- γ ，可降低IL-2的用量。
研究发现，IFN-γ加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相关。先加入IFN- γ，培养24后再
加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。
IL-1α(白细胞介素-1α)
IL-1α也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1α与IFN-γ和激发型
CD3 单抗合用时，可以明显提高CIK 的细胞毒作用。
细胞制备
1．外周血单个核细胞的采集
1.1 用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80 - 100ml；
1.2 淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)。
1.3 无血清培养液洗涤2 次，获得纯度在90%以上的PBMC，细胞数量需达到 1-3 x108。
2． (可选步骤) 肿瘤抗原的制备
用于负载DC
的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-Associated
Antigens, TAA)，也可以是肿瘤全细胞抗原。用TSA 或TAA 负载的DC
具有很好的靶向性，但该方法具有已确定的肿瘤特异性抗原或抗原肽种类少和单一抗原的免疫攻击经常无法杀伤肿瘤细胞等缺陷。而用肿瘤全细胞抗原负载DC
可克服这些缺陷，因为此时无需知道那些抗原是肿瘤细胞的TSA 或TAA，而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击DC
可诱导产生针对不同抗原决定簇的细胞毒T 淋巴细胞(CTL)克隆，从而实现对肿瘤细胞的有效杀伤。肿瘤细胞全抗原负载DC
的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载DC、用凋亡肿瘤细胞负载DC、用坏死或死亡的肿瘤细胞负载DC，用肿瘤活细胞负载DC，和将肿瘤细胞与DC
融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞裂解液负载DC，因该方法简单、快速、有效。反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：
2.1 手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；
2.2 无菌生理盐水洗3 次；
2.3 用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640 培养基，充分研磨；
2.4 200 目无菌网过滤后收集单细胞悬液；
2.5 用RPMI 1640 培养基重悬细胞至1-2 x 107/ml，装入5ml 无菌冻存管中；
2.6 将冻存管浸入液氮中速冻，10 min 后取出，再迅速放入37℃水浴中解冻10 min。
反复3-5 次；
注：也可以-80℃/37℃反复冻融3-5 次。
2.7 将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min；
2.8 收取上清，0.22μm 滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；
2.9 -80℃保存备用。
3． CIK 细胞的培养及鉴定
3.1 步骤1 中获得的PBMC 用无血清培养液调整细胞浓度至2 x 106/ml，置于培养瓶
内；
3.2 37℃，5%CO2 培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁;
3.3 收集悬浮细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至1-2 x 106/ml；
3.4 加入1,000 U/ml 的重组人IFN-γ培养；
3.5 24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细
胞的生长和增殖；
注：此时也可同时加入100 U/ml 的重组人IL-1α。
3.6 每3 天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；
3.7 在培养的第7d，收获CIK 细胞，此时数量应达到1x 109 个以上。
3.8 CIK 细胞质控：
3.8.1 台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
3.8.2 用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8 和CD56 等分子的表达，观察CD3+CD56+细胞的比例是否明显提高。
4． DC 细胞的培养及鉴定
4.1 步骤3.2 中剩下的贴壁细胞(主要是CD14+的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1,000U/ml 和重组人IL-4 500U/ml 的无血清培养液，37℃，5%CO2 培养箱中
培养，诱导单核细胞向DC 细胞分化；
4.2 每3d 半量换液一次，并补足细胞因子；
4.3 (可选步骤) 在培养的第5d，加入步骤2 中获得的肿瘤抗原50 μg/ml，对DC 进
行抗原负载；
注：若不对DC 进行抗原负载，该步省略。
4.4 在培养的第6d，加入重组人TNF-α(500U/ml)，诱导DC 细胞成熟；
4.5 在培养的第7d 或第8d，收获DC 细胞，其数量应达到1×106 个以上；
4.6 DC 的质检：
4.6.1 台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
4.6.2 流式细胞仪检测DC 细胞表面HLA-DR、CD83 和CD86 等分子的表达，以
确定DC 是否成熟。
5. DC-CIK 细胞的制备和质检
5.1 收集步骤4 和步骤3 中所获得的DC 细胞和CIK 细胞，按1∶10 (数目比)的比例
共培养，无血清培养液中添加重组人IL-2 (300 U/ml)；
5.2 每3 天半量换液一次，并补加重组人IL-2 (300U/ml)。
5.3 在第7d 收集细胞，细胞数量应达到1×1010 个以上；
5.4 DC-CIK 细胞的质检：
5.4.1 台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；
5.4.2 流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56 等分子的表达：CD3+CD56+细
胞的比例应在20%以上。
5.4.3 细胞杀伤实验：以DC-CIK 细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细
胞或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10 : 1(数目比) 的比例加
入96 孔U 型板中，每孔含靶细胞1 x 104 个，终体积为200 μl，设3 个复
孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检测效应细胞
对靶细胞的杀伤率。
5.4.4 收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，
及内毒素(标准：病原学检测阴性，内毒素<5 Eu)。
