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基因枪法转化小麦实验——DNA包裹金粉颗粒

2019.4.10
实验材料

BIO-RAD 亚微米金粉

试剂、试剂盒

无水乙醇TE 缓冲液亚精胺

仪器、耗材

离心管

实验步骤

1. 准备金粉颗粒

( 1 ) 称取 20 m BIO-RAD 亚微米金粉(0.6 μm) 至 1.5 ml 离心管中,加入 1 ml 无水乙醇。超声波处理 2 min,短暂离心 3s,然后弃上清。重复用乙醇洗两遍。

( 2 ) 加入 1 ml 无菌水,超声波处理 2 min,短暂离心 3s, 然后弃上清。重复一次。

(3 ) 加入 1 ml 无菌水,涡旋振荡重悬。每 50 μl 分装到 1.5 ml 离心管,每次分装前用涡旋振荡混匀,确保金粉均匀分布。分装好后 -20℃ 储存。

2. DNA 包裹金粉颗粒

下面的操作步骤最好在冰上无菌环境中操作。

( 1 )  取出分装的 50 μl 金粉悬浮液室温融化(见第 3.2 节步骤 1  ),超声波处理 1~2 min (见注 30 ) 。然后涡旋混匀确保完全重悬,特别是需要进一步分装更小体积时更需注意(见注 31 ) 。

( 2 )  加入 5 μl DNA (TE 缓冲液或者水溶解的 1 mg/ml DNA) (见注 32 ) 或者水(见注 33) ,涡旋振荡使 DNA 与金粉充分接触(见注 34)。

( 3 )  在离心管盖加入 50 μl 2.5 mol/L CaCl2 和  20 μl 0.1 mol/L 亚精胺(见注  35 ) ,混匀后再加入离心管内。涡旋混匀,高速短暂离心 3~5 s,沉淀金粉-DNA 复合体。弃上清。

( 4 )  加入 150 μl 无水乙醇漂洗金粉-DNA 复合体颗粒,使颗粒充分重悬(见 注 36 和注 37)。高速短暂离心 3~5 s,沉淀金粉-DNA 复合体。弃上清。

( 5 ) 最后悬浮于 85 μl 乙醇中,放在冰上待用(见注 38)。


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