基因枪法转化大麦实验
| 实验材料 | |
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| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1. 组织培养基的准备 ( 1 ) 首先准备所需浓度 2 倍的植物凝胶，高压灭菌（见注 2 ) 。 ( 2 ) 所有的组织培养基都要过滤灭菌，因此除了无菌的储备液，其他培养基成分按所需浓度 2 倍的量混匀，调到合适的 pH 后过滤灭菌（使用瓶顶过滤器、0.22 μm 微孔滤膜）。 ( 4 ) 将所需储备液在无菌条件下加入到热的培养基中，培养基和植物凝胶混合后倒入 9 cm 培 养皿中（Sterilin)。 ( 6 ) 渗透处理时，使用 5 cm 小培养皿 （Sterilin) 。 2. 幼胚的分离 (1) 幼穗的采收与消毒 ① 当幼胚直径长到 1~2 mm 时米收麦穗（见注 3) 。 ② 在取麦穗之前，从每一穗中间取一粒种子，查看幼胚的大小，确保达到所需的要求 [ 可参考第 9 章「农杆菌介导的大麦转化方法」，图 9.2 (a ) ~（c ) ] 。 ④ 先用 70% 的乙醇冲洗 30s，再用蒸馏水冲洗 3 遍，然后在次氯酸钠（Fluka 71696) 与水比 例为 50：50 的溶液中浸泡 4 min，再用蒸馏水冲洗 4 遍 ，最后将水倒掉但保持种子湿润，置于 无菌的螺口瓶中待用。 所有的操作均在超净台中进行： ① 每次大约取 20 粒无菌种子，置于解剖镜无菌的蓝色或黑色底板上，用一只镊子固定种子，另一 只慑子剥出幼胚，去除胚轴（见注 4) 。 3. 制备 DNA 包裹的金粉微粒 (1) 制备金粉母液 DNA 包裹金粉微粒的方法与文献 [ 9 ] 中的方法相似 ① 称 40 mg 金粉于 1.5 ml EP 管中，加入 1 ml 100% 乙醇。 ② 涡旋振荡使金粉充分混匀，离心使其沉淀。 ③ 倒掉乙醇，重复步骤 2 两次。 ④ 最后一次离心后，去除乙醇，加入 1 ml 无菌水涡旋振荡使之重悬。 ⑤ 将金粉以 50 μl 分装于无菌的 EP 管中，分装时注意不断混合以保持金粉颗粒处于悬浮状态， 分装后保存在 -20°C 。 ① 将装有 1 g 亚精胺（Sigma- Aldrich) 的瓶子置于 65°C 水浴锅中加热使之融化。 ② 用移液枪取 14 μl 溶液分装于无菌的 1.5 ml 离心管中，-20℃ 储存待用。 (3) 金粉微粒的包裹 ① 从冰箱中取出亚精胺，并使其解冻。 ② 加入 986 μl 无菌水，涡旋振荡混合。 ③ 用 1 ml 过滤器和小的过滤器滤头（Minisart 0.2 μm 过滤器，Sartorius) 将溶液过滤到 无菌的 1.5 ml 离心管中，制成 0.1 mol/L 亚精胺溶液。 ⑤ 沿装有金粉的离心管管壁，加入 5 μl DNA ( 1 μg/μl) ，立即涡旋振荡使金粉和 DNA 充 分混合（见注 5) 。 ⑥ 然后将 50 μl 2.5 mol/L CaCl2 和 20 μl 0.1 mol/L 亚精胺加入到离心管管盖中，盖好 盖子，颠倒离心管使 CaCl2 和亚精胺与金粉颗粒混合（颠倒离心管之前不能让 CaCl2 和亚精胺与 金粉颗粒混合），立刻涡旋振荡使所有组分充分混合。 ⑧ 去除上清液，加入 250 μl 100% 乙醇，用枪头轻轻吹打混匀，然后涡旋振荡，这个过程是洗 涤包埋了 DNA 的金粉微粒。 ⑩ 涡旋振荡重悬金粉颗粒。DNA 包埋的金粉微粒即微载体已制备完毕。 4. 粒子轰击幼胚 (1) 幼胚渗透处理 轰击前，取分离 1 天后的幼胚，放在高渗培养基中处理 4 h。每皿 20~30 枚幼胚，置于培养皿 中心 1.6 cm2 范围内，盾片朝上。胚可以放得紧密一些，但相互之间不要碰到。轰击之后幼胚继续 高渗处理 16 h。 (2) 基因枪准备 ① 基因枪所有组件和内部的枪体都要用 100% 乙醇清洗消毒。终止屏和载体膜浸泡在乙醇中消毒， 然后晾干。破裂盘在用之前浸泡在异丙醇中，无需再消毒。 ② 载体膜晾干后，先放入载体膜支架，然后吸取 3.5 μl 包裹了 DNA 的金粉微粒点到每张载体 膜中央。吸取金粉微粒时注意保持悬浮状态。 基因枪的各个组件在轰击室的位置如下： 破裂盘和载体膜之间的距离：2.2 cm 载体膜和终止屏之间的距离：1.3 cm 终止屏和样品架之间的距离：5.8 cm (枪体基部往上第三挡） 真空度：28 in.Hg. (4) 粒子轰击 ① 在轰击幼胚之前，基因枪先空轰击两次（见注 6) 。 ② 将 1100 psi 的破裂盘在异丙醇中浸泡后放置在破裂盘固定帽内，然后将固定帽连接到基因枪 腔体内的氮气气体加速管，基部旋紧。 ③ 将终止屏放入微载体发射组件中，然后把点有金粉微粒并已干燥的载体膜放入载体膜支架，安 装在固定槽中（载体膜有金粉微粒的一面朝下），旋上盖子，将微载体发射组件放在破裂盘固定帽下面 的位置上。 ④ 把放有幼胚的培养皿放在样品架上，样品架置于从轰击室底往上数的第三挡上，拿走培养皿盖，关 上轰击室门，抽真空使真空度达到 28 in.Hg 后保持，然后轰击。 ⑥ 轰击后的幼胚在 25°C 暗培养。 5. 转化子筛选 ( 1 ) 轰击后 16 h，将幼胚从高渗培养基转移到含有 5 mg/L 双丙氨膦的愈伤组织诱导培养基中进 行选择，25℃ 暗培养。 ( 2 ) 每隔两周更换一次含有 5 mg/L 双丙氨膦的愈伤组织诱导培养基。 ( 3 ) 选择培养 4 周后，即第二次更换培养基时，将来源于同一个幼胚的愈伤组织分成 3~6 个小块， 并做好标记，保证来源于同一个幼胚的所有愈伤组织在一起。 ( 4 ) 选择培养 6 周后，即第三次更换培养基时，将剩余健康的愈伤组织转移到含有 1 mg/L 双丙氨 膦的过渡培养基中，在 25℃ 弱光下培养，即把培养皿放到有光照的组织培养室中，在每个培养皿上盖 一张薄纸片。 6. 转基因植株再生 ( 1 ) 在过渡培养基上培养两周后，将来源于同一个幼胚的组织转移到再生培养基上（图 8.2) 。用深 度大的培养皿，培养基不加任何生长调节剂，只含有 1 mg/L 双丙氨膦。每 2 周用同样的培养基进行继 代，直到不再有新的再生苗长出。 ( 2 ) 当幼苗的芽长到 2~3 cm，也形成根时，从培养皿中移出转移到含有 12 ml 愈伤诱导培养基的玻 璃试管（Sigma C-5916) 中。培养基不加任何生长调节剂，只含有 1 mg/L 的双丙氨膦。 ( 3 ) 当长根的幼苗长到试管顶部，就可以转移到土壤中。用长镊子轻轻地将幼苗从试管中移出，根部 的组织培养基用水冲洗干净。 ( 4 ) 将幼苗用同样的大麦生长介质种在直径为 5 cm 的盆中，幼苗上面盖一个有孔的塑料杯以保持湿 度，直到幼苗在土壤中定植良好。 ( 5 ) 当幼苗在土壤中扎根后，就可以采集叶片分析目的基因是否存在。双丙氨膦选择不像潮霉素选择 那样（详见第 9 章 「农杆菌介导的大麦转化方法」），一些非转化的植株也可能存活。 ( 6 ) 快速简易的检测再生植株转化状态的方法是用叶片进行除草剂抗性测试 [8]。  7. 用基因枪进行瞬时检测 基因枪轰击的一个重要用途是进行瞬时分析，常用于稳定转化前对载体的检测。在瞬时分析时，装有 幼胚的培养皿一般轰击两次以提高
DNA 的转化量，建议在两次轰击间以 90° 角转动培养皿（见注 7 ) 。图 8.3 ( a ) 和图 8.3 ( b ) 分别是用含有葡萄糖苷酸酶基因( gus ) 和绿色突光蛋白基 因（gfp）的金粉微粒轰击幼胚后进行瞬时表达的两个示例。  |
