3.1 这个蛋白质是糖蛋白吗
只有一种方法能全面的回答“这个蛋白质是糖蛋白吗?”这个问题。这需要使用能检测并定量印记上糖蛋白的总糖检测试剂盒。Roche Applied Science 公司商业出品----DIG 聚糖检测试剂盒（产品包含使用说明）提供了这些测定所需的试剂。需要指出的是，在使用这个试剂盒时，蛋白质至少结合有一个糖苷部分才能获得实验结果，这些检测无法提供参与糖基化的寡聚糖分子的类型和其与蛋白骨架连接的相关信息。
3.2 蛋白质是怎样被糖基化的
有几种方法可以用来进行糖蛋白上糖苷特性的鉴定，一种方法包括应用糖蛋白寡糖部分的特异性探针的 Western印迹实验，这种探针有凝集素型和抗体型两种类型。这个方法既不需要进行糖蛋白样品的纯化，也不需要糖苷的解离或分离（见 25. 3. 2 节 1.1)。另一种方法是分离糖蛋白，直接分析与糖蛋白连接的糖苷的单糖组成（见 25. 3.2 节 2.1)。还有一种方法是经化学或酶学处理，将纯化获得的糖蛋白上的糖苷选 择性解离下来。接着通过电泳或质谱对去糖基化之前或之后的糖蛋白进行分析（见 25. 3. 2 节 2.1)。选择性裂解会为我们带来与糖蛋白连接的糖苷的特性。与此同时，通过质谱鉴定到的蛋白分子质量的差异将为我们提供与糖蛋白连接的糖苷的结构信息。
1. Western 印迹检测糖苷的方法
一维或二维电泳胶的 Western 印迹可用来检测糖蛋白上糖苷。用于这种检测的探针大多具有 N- 连糖苷特异性。
1 ) 凝集素亲和检测
凝集素是一类可与寡聚糖部分特异结合的植物蛋白质，它们已被鉴定出具有对哺乳动物糖蛋白的亲和性，这些凝集素列于表25-1 中，其中只有一少部分可用于植物糖蛋白的检测（见注释 2) 。
这类凝集素商品是凝集素-生物素化形式。通过链霉亲和素-辣根过氧化物酶标识物，辨别凝集素和寡糖。但是，唯有刀豆球蛋白 A 例外，因为它可直接结合到过氧化物酶上。下面是这两种方案的具体内容：
凝集素- 生物素/链霉亲和素-过氧化物酶方法：
( 1 ) 通过 1D 或 2D 电泳分离，并转移到硝酸纤维素膜上。
( 2 ) 用 TTBS 缓冲液浸泡印迹膜 1 h ( 见注释 3) 。
( 3 ) 将印迹膜在含有凝集素-生物素复合物（0.1 mg/20 ml) 的 TTBS 缓冲液中，室温下浸泡 2 h。
( 4 ) 在 TTBS 缓冲液中漂洗 4 次，每次 15 min。
( 5 ) 将印迹膜在以 1：1000 稀释在 TTBS 缓冲液中的链霉亲和素-辣根过氧化物酶标物中，室温下温育 1 h。
( 6 ) 在 TTBS 缓冲液中漂洗印迹膜 4 次（每次 15 min) ，显影前在 TBS 溶液中漂洗一次。
( 7 ) 在一个烧杯中将 30 mg 4-氯-1- 萘酚溶解在 10 ml 冷甲醇中（一20℃），在另一个烧杯中的 50 ml TBS 缓冲液中加入 30 μl H2O2。在要显影印迹膜时，合并上面这两个烧杯中的溶液，配制成过氧化物酶显影混合液（要现用现配），轻轻摇动来优化显影反应。
( 8 ) 倒掉显影混合液，并用蒸馏水漂洗印迹膜数遍，终止显影反应。晾干印迹膜，夹在两层滤纸之间保存。
( 9 ) 实验对照，请见注释 4 。
刀豆球蛋白 A (ConA)- 过氧化物酶方法（根据参考文献 20 修改的方法)。
( 1 ) 通过 1D 或 2D 电泳分离，并转移到硝酸纤维素膜上。
( 2 ) 用 TTBS 缓冲液浸泡印迹膜 1 h。
( 3 ) 将印迹膜在含有 ConA ( 25 μg/ml）的 TTBS 缓冲液中，室温下温育 2 h。
( 4 ) 在 TTBS 缓冲液中漂洗 4 次，每次 15 min。
( 5 ) 将膜放置在含辣根过氧化物酶（HRP，50 μg/mL) 的 TTBS 缓冲液中，室温下温育 1 h。
( 6 ) 在 TTBS 缓冲液中漂洗印迹膜 4 次（每次 15 min)，显影前在 TBS 溶液中漂洗一次。
( 7 ) 过氧化物酶的显影作用与凝集素-生物素/链霉亲和素-辣根过氧化物酶方法中的相同。
( 8 ) 实验必须设对照，见注释 4。
2 ) 特异性抗体的免疫检测方法
我们已经报道了植物 N-复合糖苷的 β-1-2 木糖和 α-1-3-岩藻糖抗原表位在兔子血清中具有高免疫 [21] 。因此，含复合糖苷的糖蛋白抗血清往往含有抗 β-1-2 戊醛糖和 α-1-3 海藻糖的抗体。一些商业免疫血清与我们自制的探针具有相同的特性。如抗 HRP 的免疫血清可用作植物含有 α-1-3 岩藻糖和 β-1-2 木糖残基的复合 N-糖苷的特异性探针。从蜂毒蛋白中获得的免疫血清具有更强的特异性，可用作含 α-1-3 岩藻糖的植物复合糖苷的特异性探针[ 21] 。我们在实验室，从兔血清中获得了对复合型糖苷末端天线（三糖 Lewisa ) 的特异性兔抗体 [22] 。抗 Lewis a 的单克隆抗体已商业化，但其非常昂贵。
阿拉伯半乳糖蛋白（AGP ) 和伸展蛋白可用商业单克隆抗体检测（http://W W W . plantprobes.co.uk/) 。我们实验室没有使用过这些抗体，请参考描述这些抗体特异性的原始论文（见注释 5) 。
( 1 ) 通过 1D 或 2D 电泳分离，并转移到硝酸纤维素膜上。
( 2 ) 用 含 3% 明胶的 TBS 缓冲液，室温下浸泡印迹膜 1 h。
( 3 ) 用 含 1% 明胶和适宜稀释浓度的免疫血清的 TBS 缓冲液，室温下浸泡印迹膜 2 h。我们使用的 25. 2.2 节 1.2 ) 中提到的商业免疫血清，稀释方法如下：
a. 兔抗 HRP 免疫血清，1 : 300。
b. 兔抗蜂毒蛋白免疫血清，1 : 200。
c. 鼠抗 Lewis 单克隆抗体，1 : 100。
( 4 ) 在 TTBS 缓冲液中漂洗 4 次，每次 15 min。
( 5 ) 用 含 1% 明胶和适当的标记抗体的 TBS 缓冲液，室温下浸泡印迹膜 1 h。标记抗体可为 1 : 2000 稀释的 HRP 标记羊抗兔 IgG (G 型免疫球蛋白）抗体，或 1 : 500 稀释的 HRP 标记羊抗鼠多价免疫球蛋白抗体。
( 6 ) 在 TTBS 缓冲液中漂洗印迹膜 4 次（每次 15 min) ，显影前在 TBS 溶液中漂洗—次。
( 7 ) 过氧化物酶的显影作用与凝集素-生物素/辣根过氧化物酶方法中的相同（ 见 25.3.2 节 1.1)。
( 8 ) 对照见注释 6 和注释 7。
2. 糖苷单糖组分的分析
糖苷单糖组分的分析是通过用甲醇-HCl 溶液水解糖蛋白，然后用气相色谱鉴定和分析单糖产物及其衍生物。单糖组分分析结果提供了连接到糖蛋白和/或 N-连寡聚糖）上的糖苷类型的初步数据。
( 1 ) 将 1 mg 纯化的蛋白质样品放入带聚四氟乙烯涂层的螺旋盖子的玻璃管中，进行冻干处理（见注释 8) 。
( 2 ) 向待测蛋白质样品中加入 5~10 μl 的 2 mmol/L 肌醇贮藏液（见注释 9) 。甲醇分解反应之前再次冻干处理样品。
( 3 ) 在蛋白样品中加入 500 μl 浓度为 1 mol/L 甲醇-HCl 溶液，旋紧盖子，置于 80°C 加热过夜。
( 4 ) 甲醇分解反应后的样品在氮气保护下，40°C 加热干燥处理样品。注意：因甲醇有毒，应在通风橱中操作。
( 5 ) 用 250 μl 甲醇漂洗，如步骤（4 ) 的操作，在氮气环境下干燥处理样品，重复漂洗步骤两次。
( 6 ) 用 250 μl 甲醇重悬样品，接着加入 25 μl 的乙酸，25 μl 吡啶，匀浆，在室温下放置 6 h，如步骤（4 ) 的操作，在氮气环境下干燥处理样品。
( 7 ) 加入 250 μl 的硅烷化试剂，80°C 温育 20 min ( 见注释1) ，空气吹干样品。
( 8 ) 用 1 ml 环己烷冲洗，空气吹干，并重悬于 200 μl 环己烷中，匀浆，离心，将 100 μl 衍生物样品转移到带盖的反应小瓶中。
( 9 ) 设置气相色谱仪的氦气压强设为 1.4 bar，注入样品前要将注射器和 FID 检测器分别加热到 250°C 和 280°C 。设置氦气的压力为 20 psi，流速为 3 ml/min。在注入 5 μl 的衍生物样品（相当于 25 μg 蛋白质）之前，平衡色谱柱的温度到 120°C。温度梯度洗脱单糖衍生物：① 每分钟升高 10~160°C。② 每分钟升高 1.5~235°C。③ 235°C 4 min。 ④ 每分钟升高 20~280°C。⑤ 280°C 3 min。
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