研究背景
外周神经系统（PNS）损伤后的修复涉及到非常复杂的生物学功能。壳聚糖作为一种人工神经导管，在治疗PNS修复过程中有非常显著的效果。当然，在这个过程中，壳聚糖的作用不仅仅是作为神经修复的支架，其降解产物壳寡糖（COS）是具有促进组织再生功能的。然而，目前这种现象的具体作用机制还不是很清楚。本研究组之前的研究发现，COS通过miR-27a/FOXO1促进细胞周期，刺激Schwann cells（SCs）增殖而促进神经细胞再生。在本研究中，我们发现新COS通过调控miR-327,刺激SCs细胞分泌趋化因子，进而诱导巨噬细胞创造稳定微环境，使得神经能够再生。
研究思路
研究结果
1. COS促进受伤坐骨神经处SC增殖和轴突延伸
为探究COS对神经修复的作用，我们首先通过大鼠模型，在受伤坐骨神经移植COS和阳性对照NGF及盐处理对照。12天后的表型分析显示，COS和NGF组修复都非常好，SCs增殖显著，NF阳性轴突显著增加。因此，这部分的建模实验和处理，非常好地表明了COS对神经修复的作用。
2. COS诱导炎症因子表达和巨噬细胞招募
已有的研究发现器官再生时的微环境塑造过程中，炎症因子扮演着非常重要的作用。因此，我们首先检测了受伤后不同时间点的炎症因子表达。结果显示，TNF-α，IL-6，IL-1β快速升高，表明炎症细胞可能被招募到受伤区。通过免疫染色，我们发现CD68阳性细胞在4天就达到峰值。因此，这些数据都表明，COS会快速激活炎症因子表达和巨噬细胞积累。
3. COS依赖于SCs刺激巨噬细胞迁移
那么，COS招募巨噬细胞的内在机制是什么呢？利用巨噬细胞模型RAW246.7，我们进行了COS处理，发现迁移没有明显变化。因此，我们在此基础上，通过wound-healing实验，我们把COS处理的RAW246.7与SCs共培养。结果表明，巨噬细胞发生了迁移，且被COS强化，但又不是因为增殖引起。因此，COS依赖于SCs刺激巨噬细胞迁移。
4. COS引起SCs内的miRNA和mRNA变化
我们前期的测序结果（该研究中RNA测序服务由伯豪生物提供）表明COS处理SCs后，有172个差异miRNA和4399个mRNA表达变化。在这里，我们重点关注了伤口应激，免疫应激，TNF胞内反馈，器官再生和细胞因子调控信号通路。GO和KEGG功能富集显示，共有51个miRNA和77个mRNA符合以上指标。进一步的miRNA和mRNA网络构建，我们现在共有两个大类出现：一个涉及到增殖，包含miR-182,miR-345-5p等；一个涉及到炎症，包含miR-327,miR-193-3p，miR-20a-5p，CCL2,CCL7等。同时，miR-327,miR-193-3p的潜在靶基因是CCL2, miR-17-5p和 miR-106-5p的潜在靶基因是CCL7。因此，我们把他们作为接下来研究的候选。
5. MiR-327在SCs中降低CCL2的表达
当SCs处理COS后，miR-327下调，CCL2显著上调，而miR-193没有显著变化。所以，可能是miR-327在SCs中调控了CCL2。因此，我们用荧光素酶报告系统进行了验证，确实发现miR-327可以结合到miR-327的3’UTR区，抑制其表达。
6. SC中的MiR-327/CCL2调控巨噬细胞迁移
为确认miR-327/CCL2是否参与巨噬细胞的招募过程，我们进行了transwell 迁移实验。通过在SCs中siRNA敲降CCL2,我们发现RAW264.7细胞的迁移能力减弱。同样，miR-327的过表达和敲降实验也得到了一致的结果。
7. COS调控坐骨神经中的miR-327/CCL2
以上的功能实验都是基于细胞，那么，在真实的坐骨神经受伤时，miR-327/CCL2调控通路是否存在的？我们在大鼠COS移植外周神经缺陷模型后，检测miR-327的表达。结果显示，术后1天和4天，表达显著降低，而CCL2显著增加。因此，SCs中的CCL2在招募巨噬细胞在创口处营造适宜微环境影响神经再生过程中，确实发挥了非常重要的调控作用。
研究结论
我们的研究通过模型构建和检测，发现壳聚糖降解物COS在神经修复过程中有重要作用。运用高通量测序和后续实验验证，我们阐明了COS通过SC s中的miR-327，调控CCL2的表达，进而影响了巨噬细胞的迁移和招募，最终通过伤口处的微环境重塑而影响外周神经再生的生物学机制。我们的研究为理解壳聚糖降解物在神经修复过程中的作用提供了理论依据。
原文出处：Zhao Y, Wang Y, Gong J, et al. Chitosan degradation products facilitate peripheral nerve regeneration by improvingmacrophage-constructed microenvironments.Biomaterials,2017.
