Pacific Biosciences 单分子实时测序
Pacific Biosciences单分子实时测序
Pacific Biosciences单分子实时（SMRT）测序使用特殊的环接头，通过链置换扩增（SDA）或多置换扩增（MDA）从dsDNA片段中生成ssDNA，其基于滚动环扩增（RCA）。然后通过DNA聚合酶加入具有荧光磷酸基团（而不是荧光含氮碱基）的dNTP，磷酸链断裂并发光，有效地从生长的核酸链中去除荧光染料。单分子实时测序反应在数千个纳米光子可视化室中并行进行，生成测序读数。然后使用生物信息学工具将它们组装起来，以生成重叠群、染色体，并最终生成基因组序列。
Pacific Biosciences单分子实时测序优点
首先，样品制备速度非常快;这需要 4-6 小时而不是几天。此外，它在制备步骤中不需要PCR，从而减少了PCR引起的偏差和误差。二是周转率快;运行在一天内完成。第三，平均读取长度非常长（10-16 kb），比任何下一代测序技术都要长。虽然通量低于下一代测序仪，但SMRT测序不仅能发出荧光信号，还能随时间推移产生信号差异，这对于临床实验室非常有用，特别是对于微生物学研究，以组装基因组，并评估结构变异分析、单倍型分析、宏基因组学和剪接亚型鉴定。
Pacific Biosciences单分子实时测序缺点
使用该系统进行直接RNA测序是有问题的。这是因为核苷酸在核苷酸掺入之前反复与逆转录酶结合，从而产生多次插入的错误信号，从而无法确定有意义的序列。此外，该系统的低读取计数将限制其识别常见的mRNA亚型，而不是定量表达谱或完整的转录组覆盖率。
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