本方案以哺乳动物穿梭载体 pSPL3 为例，描述了外显子扩增的方法，内容分为以下五个阶段。阶段 1: 文库的构建; 阶段 2: 电穿孔法将文库转染 COS-7 细胞; 阶段 3:mRNA 的提取; 阶段 4: 反转录 PCR; 阶段 5: 克隆分析。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）上册，作者：黄培堂。
| 实验材料 | 大肠杆菌菌株 HB101质粒 pSPL3COS-7 细胞载体 pBluescriptⅡ大肠杆菌 DH5α |
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| 试剂、试剂盒 | pSPL3 多克隆位点图谱限制性内切核酸酶PvuⅡT4DNA 连接酶LB 琼脂平板黏粒载体TESOC 培养基琼脂糖凝胶LB 肉汤培养基PBS胰酶-EDTA 溶液DNADMEMDEPC 处理水乙醇NaClTMK 缓冲液SDSDTTdNTP 溶液Bst XIEcoR VMo-MLV 反转录酶Taq DNA 聚合酶DNA 尿嘧啶糖基酶RNase 抑制剂 |
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| 仪器、耗材 | 水浴箱离心转头电穿孔转染设备以电转染槽组织培养平皿宽口加样器头细胞刮子或橡胶刮聚苯乙烯离心管热循环仪多通道加样器或加样装置 |
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| 实验步骤 | 阶段 1: 文库的构建
材料
缓冲液与溶液
按合适比例稀释贮存液。
ATP(10 mmol/L)
酚：氯仿（1:1,V/V)
TE(pH8.0)
酶及缓冲液
PvuⅡ
限制性内切核酸酶
pSPL3 多克隆位点图谱见图 11-16
T4DNA 连接酶
凝胶
琼脂糖凝胶（0.9%m/V), 用 TAE 配制
见步骤 3
琼脂糖凝胶，预制
见步骤 1
核酸与寡核苷酸
黏粒载体、大肠杆菌人工染色体或酵母人工染色体 DNA, 含有靶标基因组 DNA 区域。
用于分析的重组子 DNA 纯化方法见第 4 章。
或基因组 DNA
按第 6 章提供的方法之一制备
培养基
含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板
参见步骤 8 决定平板的合适规格。
含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 肉汤培养基
SOC 培养基
专用设备
预设溫度为 15°C 和 65°C 的水浴
附加试剂
本方案步骤 8 需要的试剂列在第 1 章，方案 20。
本方案步骤 6 需要的转化所需试剂列在第 1 章，方案 23、24 或 25。
本方案步骤 10 和 12 需要的试剂列在第 1 章，方案 1 或 9。
载体与菌株
大肠杆菌菌株 HB101, 处于转化感受态
按第 1 章，方案 23,24 或 25 制备。
质粒 pSPL3
Life Technologies 公司提供单独的或作为试剂盒组分的质粒 pSPL3。
方法
1. 对 pSPL3 进行限制酶切以插入基因组 DNA(pSPL3 多克隆位点图谱见图 11-16)。对线性化的质粒 DNA 去磷酸化处理，电泳并从凝胶中回收纯化质粒。
质粒 DNA 酶切完全非常重要，产物应为大小约 6kb 的单一片段。
2. 用与上一步相同的限制酶消化 1~2ug 的基因组 DNA 或含有目的基因组 DNA 的重组质粒。
3. 用 0.9% 的琼脂糖凝胶电泳（TAE 体系）分析 10% 的基因组酶切产物。
基因组 DNA 须酶切完全而无降解。凝胶电泳分析时，注意观察有无污染细菌（或酵母）基因组 DNA, 污染的 DNA 通常呈弥傲的背景条带。
4. 将基因组 DNA 酶切体系置 65°C15 min 终止酶切反应，酚: 氯仿抽提并用标准的乙醇沉淀法回收 DNA。产物溶于 TE(pH8.0), 浓度为 100ug/ml。
5. 混合以下组分将基因组 DNA 连接到载体上：
酶切后的基因组 DNA 150ng
酶切并经去磷酸化的 PSPL3 50ng
10x 连接反应缓冲液 1ul
T4 噬菌体 DNA 连接酶 10Weiss 单位
加 H2O 至 10ul
室温温育 2~3 h 或 15°C 过夜。
10X 连接反应缓冲液组分已添加 ATP, 则反应混合物中可加入更大体积的载体或外源 DNA。使用商品化的含 ATP 的连接续冲液，则无须添加 ATP。确保引入只有载体 DNA 的对照，这对于评价构建的文库的质量非常重要。
6. 用连接反应产物转化 40ul 的 HB101 感受态细胞。
确保用阳性对照（载体 DNA) 和阴性对照（无 DNA 体系）同时转化以评价转化效率。
重要：由于在其他菌株中 pSPL3 复制不稳定，使用 HB101 作为文库和载体扩增的宿主是必须的（Churchand Buckler1999)。
7. 转化后菌液中加入 800ul 的 SOC 培养基，37°C 培养 30~45 min 使质粒编码的抗生素抗性标记基因表达。
8. 在氨苄青霉素存在下 37°C 摇菌过夜以扩增文库。
如使用单个黏粒：将 100ul 转化混合物涂布一个含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板。剩余的加入含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 肉汤液体培养基 2 ml 继续培养。
取小量转化物在 LB 平板上培养可评价转化效率。
如使用 BAC、PAC 或黏粒库：将所有转化混合物涂布在多个 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板（150 mm) 上。
这样处理是为了消除因营养竞争而导致的某些克隆的优势生长，使构建的文库更具代表性。
9. 通过比较重组子与非重组子数目估计连接效率（也就是与只有 pSPL3 的连接混合物转化 HB101 所得克隆数进行比较)。
重组子至少应达到非重组子的 500 倍到 1000 倍。
10. 如在 150 mm 平板上进行文库扩增，直接进入步骤 11。对于在液体肉汤培养基中扩增的基因组文库，用标准的碱变性法（见第 1 章，方案 1) 或质粒提取试剂盒纯化质粒，然后进入步骤 13。
11. 如整个库铺在大的 LB 琼脂平板上，则加入 10 ml 肉汤培养基浸没平板，并小心从琼脂表面将菌落刮下来，尽量减少刮入肉汤中的琼脂量。
12. 用经过修改的标准碱变性法小量质粒提取程序纯化步骤 11 中获得样品中的质粒，依次加入细菌沉淀中的试剂量调整为碱裂解液Ⅰ(300ul), 裂解液Ⅱ(600ul) 及裂解液Ⅲ(450ul)。为简化程序，在加入碱裂解液 I 后，将细菌悬液移入一个 2 ml 离心管中，这样其余程序可在此离心管中完成。在加入溶裂解液Ⅲ并离心后，将粗制的质粒上淸分为两份置于两个 1.5 ml 离心管中。用酚：氯仿及氯仿对上清进行抽提，获得的上清用异戊醇沉淀，最后合并两管中的 DNA 重悬液。也可用商品化的质粒提取试剂食完成此步（第 1 章，方案 9)。
13. 取部分纯化后的质粒 DNA 用 PvuⅡ进行酶切，通过电泳观察构建的文库质量。
PvuⅡ酶切位点靠近质粒的多克隆位点。空载体酶切产物电泳显示 4kb 和 2kb 的条带。童组克隆经切割仍可见明显的 4kb 条带，但 2kb 的条带则应很微弱或没有。2kb 条带如很明显則提示文库的质量不佳，或者 (但可能性较小）基因组 DNA 经 PvuⅡ切割成大多为 2kb 的片段（图 11-17)。如文库的质量令人满童，则可用于实验的下一步骤。
阶段 2: 电穿孔法将文库转染 COS-7 细胞
材料
缓冲液与溶液
按合适比例稀释贮存液。
无二价阳离子的磷酸缓冲液（PBS）
酶及缓冲液
胰酶-EDTA 溶液
核酸与寡核苷酸
DNA
用于转染的质粒 DNA 制备见本方案阶段 1, 步骤 10~12。
用作对照的质粒载体（步骤 3)
培养基
含 10% 热灭活胎牛血清的 Dulbecco's modified Eagle's 培养基（DMEM)
离心转头
Sorvall H1000B 转头或等同规格转头
专用设备
电穿孔转染设备以及 0.4 cm 宽的电转染槽
组织培养平皿（100 mm)
宽口加样器头
细胞与组织
COS-7 细胞
细胞须在含 10% 热灭活胎牛血清的 DMEM 培养至 75%—85% 致密。关于细胞的处理细节，包括胰酶消化，见 Spector 等（1998b)。
方法
1. 用无二价阳离子的 PBS 洗涤单层 C0S-7 细胞。通过胰酶-EDTA 处理将细胞从平皿表面消化下来。4°C、250 g(Sorvall H1000B 转头上相当于 1100r/min) 离心 10 min 回收细胞。
重要：在整个过程中须保持 COS-7 细胞处于预冷状态。
关于细胞胰酶消化细节见 Spector 等（1998b)
2. 将用于转染的 DNA 样品溶于无二价阳离子的 PBS 并调整至 100ul。
转染所需的 DNA 量应按第 16 章，方案 5 进行优化，
3. 用 700ul 无二价阳离子的 PBS 重悬 4X106COS-7 细胞。在预冷的电转染槽中混合细胞与 DNA(槽内宽 0.4 cm)。将混合物放置冰上 10 min。
PBS 体系中如含二价阳离子，将导致电转染时产生电弧，可破坏电穿孔仅。
确保应用空载体 DNA 进行电转化，作为实验对照。
4. 小心重悬细胞，按 1.2kV(3kV/cm) 和 25uF 进行电穿孔转染实验。迅速将电转槽重置于冰上，并放置 10 min。
电穿孔转染条件按第 16 章，方案 5 描述的方法进行优化。
5. 用宽口加样器头将 1x106 的电转染后的细咆转入 100 mm 的组织培养平皿中，每个平皿已加入 10 ml 预热至 37°C 的含 10% 热灭活胎牛血清的 DMEM 培养基。在设定 37°C、5%~7%CO2 及一定湿度的培养箱中培养 48~72 h。 |
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