外显子捕获与扩增（二）
材料
缓冲液与溶液
按合适比例稀释贮存液。
无二价阳离子的磷酸缓冲液（PBS）
酶及缓冲液
胰酶-EDTA 溶液
核酸与寡核苷酸
DNA
用于转染的质粒 DNA 制备见本方案阶段 1, 步骤 10~12。
用作对照的质粒载体（步骤 3)
培养基
含 10% 热灭活胎牛血清的 Dulbecco's modified Eagle's 培养基（DMEM)
离心转头
Sorvall H1000B 转头或等同规格转头
专用设备
电穿孔转染设备以及 0.4 cm 宽的电转染槽
组织培养平皿（100 mm)
宽口加样器头
细胞与组织
COS-7 细胞
细胞须在含 10% 热灭活胎牛血清的 DMEM 培养至 75%—85% 致密。关于细胞的处理细节，包括胰酶消化，见 Spector 等（1998b)。
方法
1. 用无二价阳离子的 PBS 洗涤单层 C0S-7 细胞。通过胰酶-EDTA 处理将细胞从平皿表面消化下来。4°C、250 g(Sorvall H1000B 转头上相当于 1100r/min) 离心 10 min 回收细胞。
重要：在整个过程中须保持 COS-7 细胞处于预冷状态。
关于细胞胰酶消化细节见 Spector 等（1998b)
2. 将用于转染的 DNA 样品溶于无二价阳离子的 PBS 并调整至 100ul。
转染所需的 DNA 量应按第 16 章，方案 5 进行优化，
3. 用 700ul 无二价阳离子的 PBS 重悬 4X106COS-7 细胞。在预冷的电转染槽中混合细胞与 DNA(槽内宽 0.4 cm)。将混合物放置冰上 10 min。
PBS 体系中如含二价阳离子，将导致电转染时产生电弧，可破坏电穿孔仅。
确保应用空载体 DNA 进行电转化，作为实验对照。
4. 小心重悬细胞，按 1.2kV(3kV/cm) 和 25uF 进行电穿孔转染实验。迅速将电转槽重置于冰上，并放置 10 min。
电穿孔转染条件按第 16 章，方案 5 描述的方法进行优化。
5. 用宽口加样器头将 1x106 的电转染后的细咆转入 100 mm 的组织培养平皿中，每个平皿已加入 10 ml 预热至 37°C 的含 10% 热灭活胎牛血清的 DMEM 培养基。在设定 37°C、5%~7%CO2 及一定湿度的培养箱中培养 48~72 h。
阶段 3:mRNA 的提取
材料
缓冲液与溶液
按合适比例稀释贮存液。
DEPC 处理水
乙醇
NaCl(5mol/L)
酚
酚：氯仿
无二价阳离子的磷酸缓冲液（PBS)
SDS(5%m/V)
TMK 缓冲液
10 mmol/LTris-HCl(pH7.5)
10 mmol/LKCl
1 mmol/LMgCl2
Triton X-100(10%V/V) 或 Nonidet P-40(4%，V/V)
离心转头
Sorvall H1000B 转头或等同规格转头
专用设备
细胞刮子或橡胶刮
聚苯乙烯离心管（15 ml), 冰上预冷至 0°C
细胞与组织
分别经重组 pSPL3 和非重组 pSPL3 转染的 COS-7 细胞
方法
1. 用冰预冷的不含钙、镁离子的 PBS 洗涤平皿中的转染 COS-7 细胞三次。洗涤过程中将平皿保持在冰上。
2. 每个平皿中加入 10 ml 预冷的 PBS。保持平皿在冰上，小心的将细胞刮除下来。
3. 将细胞悬液转入预冷的 15 ml 聚苯乙烯离心管中。
使用透明的聚苯乙烯离心管，有利于步骤 8、9 中不含细胞核的胞浆的回收。
4.4°C、300 g（Sorvall H1000B 转头上相当于 1200r/min) 离心 8 min 回收细胞。
5. 尽可能倾去上清，并用加样器除去残存的上清。
6. 在 300ulTFK 缓冲液中重悬 1X106 至 2x106 的 COS 细胞，冰上放置 5 min。
7. 加入 15ul 的 10% 的 Triton X-100 或 4% 的 Nonidet P-40, 冰上放置 5 min。
加入非离子去污剂可导致质膜的轻微破解而核膜保持完整。
8.4°C、500 g(Sorvall H1000B 转头上相当于 1500r/min) 离心 5 min 沉淀细胞核。
9. 将上清移入预冷的 1.5 ml 小离心管中。
重要：移取上淸时应异常小心，切不可触及细胞核沉淀。如核膜破裂会导致基因组 DNA 污染，样品将非常黏期而难以吸取。
10. 加入 20ul 的 5%SDS 和 300ul 的酚，剧烈振荡后最大速度离心 5 min，样品将分为有机相和水相。
11. 将水相移入含 300ul 酚: 氯仿的 1.5 ml 小离心管中，剧烈振荡后室温最大速度离心 3 min 进行分相。
12. 移取上层的水相至预冷的 1.5 ml 小离心管中，加入 120 的 5mol/LNaCl 和 750ul 的乙醇。-20°C 放置 2~3 h 或-80°C 放置 30 min 以沉淀 RNA。
核酸在乙醇中比在水中更稳定。如长期保存，RNA 应置于乙醇中-80°C 冻存（见第 7 章，方案 1 结尾部分的专栏“RNA 的保存"）。
13.4°C、最大速度离心 10 min 回收 RNA。
14. 弃上清并用 70% 乙醇洗涤沉淀。空气干燥后，将沉淀重悬于 20 g 的 DEPC 处理水中。
阶段 4: 反转录 PCR
材料
缓冲液与溶液
按合适比例稀释贮存液
10x 扩增缓冲液
氯仿
DEPC 处理水
DTT(lmol/L)
dNTP 溶液，每种核苷酸浓度为 1.25 mmol/L
酚
RNase 抑制剂
酶及缓冲液
Bst XI
EcoR V
Mo-MLV 反转录酶
Taq DNA 聚合酶
DNA 尿嘧啶糖基酶（1 单位/ul)
