ZOOM® IPGRunner™系统：简化的双向电泳（2D gel eletrophoresis）
| 摘要 |
双向电泳（Two-dimensional（2D） gel electrophoresis）是一项基于蛋白的两种不同特性：电荷和质量来分离蛋白的技术。首先基于蛋白固有电荷，通过等电聚焦（isoelectric focusing IEF）进行第一向蛋白分离，然后根据蛋白的质量，在第二向中通过SDS-PAGE电泳进行蛋白分离。使用这两种不同的分离技术的结果是增高了对蛋白的分辨率。传统的2D技术费用高昂、操作烦琐和耗费时间。ZOOM® IPGRunnerTM系统提供了进行第一向等电聚焦简单而快速的方法，无需使用矿物油。使用7cm ZOOM®固定pH梯度胶条（immobilized pH gradient IPG strips）的第一向电泳和使用NuPAGE® Novex 4-12% Bis-Tris ZOOM® Gels的第二向电泳总共可以在3小时内完成。 |
前言 |
双向电泳（Two-dimensional（2D） gel electrophoresis）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。 |
迄今为止，双向电泳技术一直是使用昂贵的专门仪器，要求大实验室的积累和专门的训练。为了保证结果的重复性，需要延长时间和技术专家的建议。 |
ZOOM® IPGRunner™系统提供了一种进行等电聚焦实验的新方法，大大地简化和加速了进行2D分离的进程。在一个一次性实验的夹盒（cassette）中的7cm固定pH梯度（IPG）胶条上进行等电聚焦，ZOOM® IPGRunnerTM夹盒(ZOOM® IPGRunner™ cassette)可以容纳多达6个胶条，并且不需要矿物油覆盖。胶条直接在夹盒中水化，使用一个特殊设计电泳核心的垂直电泳微槽（mini-cell）进行聚焦。仪器容易组装，不需要多少时间。使用ZOOM® IPGRunnerTM夹盒可以同时电泳多达12个胶条。仪器设计最佳电功率，聚焦时间短至1.5小时（图1）。在ZOOM®胶上进行第二向分离，ZOOM®胶上有一个蛋白标准加样孔和一个容纳7cm胶条的孔。当使用NuPAGE® Novex Bis-Tris ZOOM®胶时，第二向SDS-PAGE电泳需要花费40-45分钟（图1）。这个体系的简洁性使初学者易于进入到2D电泳。 |
图1 ZOOM® IPG Runner™系统step步 骤时 间1加样，插入IPG胶条，密封上样孔10分钟2再水化胶条过夜孵育3移去加样孔，放置电极芯，组装IPGRunner™ Mini-Cell5分钟4进行等电聚焦电泳90分钟5还原，烷基化，将胶条插入ZOOM®胶35分钟6进行SDS-PAGE电泳40分钟7使用SilverQuest™ Silver Staining Kit 或者SimplyBlue™ SafeStain染色90或者45分钟 |
方法 |
第一向 IEF 在ZOOM® IPG RunnerTM夹盒(Invitrogen, Cat. no. ZM0003)中再水化ZOOM®胶条，pH4-7（Invitrogen, Cat. no. ZM0012）。IPG Runner™夹盒放置在实验台，有覆盖膜窗口的一面朝上。包括2M Thiourea, 7 M urea, 0.5% ZOOM® Carrier ampholytes (Invitrogen, Cat. no. ZM0022), 2.0% CHAPS, 20 mM DTT 的再水化缓冲液（155μl）和E. coli裂解物被加入到IPG Runner™夹盒窗口。胶条的酸性（+）末端插入狭槽，胶面朝向夹盒的膜或覆盖面。用密封带（包含在试剂盒中）封闭加样孔，提供隔绝的再水化环境。胶条在室温下再水化8-16小时。每一个IPG Runner™夹盒可以进行6个IPG 胶条电泳。再水化后，移去密封带和加样孔，在IPG Runner™夹盒的每一端放置电极芯，电极芯用750μl的去离子水润湿。通过滤纸吸去过多的水分，以便电极芯保持潮而不湿。组装夹盒和缓冲液核心（buffer core），然后插入ZOOM® IPG Runner™ Mini-cell电泳槽（Invitrogen, Cat. no. ZM0001)。在Mini-cell电泳槽的外槽加入650ml水。接通电源进行等电聚集，电流限制50μA/胶条，功率限制0.1W/胶条，电压调节步骤如下： |
1 175V 15分钟 2 175-2000V 梯度 45分钟 3 2000V 30分钟 |
等电电泳结束后，拆散ZOOM® IPG Runner™ Mini-cell电泳槽，去除夹盒上的覆盖膜（film cover），平衡ZOOM®胶条进行第二向分析。 |
第二向SDS-PAGE电泳 使用NuPAGE® Novex 4-12% Bis-TrisZOOM®胶进行第二向电泳。在NuPAGE LDS样品缓冲液进行第二向平衡，缓冲液中含有还原剂和烷化剂。蛋白巯基的烷基化减少了由于SDS电泳期间二硫键的再形成和残余DTT的存在导致的垂直脱尾。ZOOM® 胶条在5ml包含50mM DTT 1X NuPAGE® LDS样品缓冲液中孵育15分钟，接下来在包含125 mM碘代乙酰胺（ iodoacetamide）的1X NuPAGE® LDS样品缓冲液中孵育15分钟。然后将每一个IPG胶条放入ZOOM®胶加样孔，再加入400μl 用合适的电泳缓冲液制备的0.5％琼脂糖溶液封盖。分子量标准(Mark12™ Unstained Protein Standard, Invitrogen, Cat. no. LC5677)上样到分子量标准孔。胶条使用NuPAGE® Novex 4-12% Bis-Tris ZOOM®胶(Invitrogen, Cat. no. NP0330)，按照标准程序在XCell SureLock® Mini-Cell 槽(Invitrogen, Cat. no. EI001)中进行电泳。200V 电泳45分钟。 |
染色 按照标准程序，使用SilverQuest™银染试剂盒（SilverQuest™ Silver Staining kit ）（ Invitrogen, Cat. no. LC6070)或SimplyBlue™ SafeStain (Invitrogen, Cat. no. LC6060)对2D胶进行染色。 |
结果和讨论 |
图2是按照图1流程E. coli 裂解物电泳后胶的图。2D电泳和染色总的时间是3小时35分钟，胶用SimplyBlue™ SafeStain 染色。使用SilverQuest™试剂盒需要4小时20分钟。两块胶进行第一和第二向电泳的总的时间2小时50分钟等电聚焦时间缩短到1.5小时，总共∽1300 volt-hours，而传统的浸油系统聚焦蛋白需要2-8小时，总的6，000-20，000 volt-hours。由于ZOOM® IPG Runner™仪器消除了回路中电阻的来源，通过胶条的实施电压接近电源的实际电压输出。这个电系统的效率允许使用2000V或者更低的电压进行完全的聚焦。 |
图2 使用ZOOM®系统的2D胶染色双向电泳的总的时间为2小时50分钟。SimplyBlue™ SafeStain Coomassie stain染色时间为45分钟，SilverQuest™ Silver Stain染色时间为1小时30分钟。 |
ZOOM® IPG Runner™系统节省时间的优点和一次性使用夹盒的方便，可以让使用者每天进行大量的第一向电泳。聚焦的后的胶条能够进行批次分析，或者贮存起来进行随后的第二向电压，夹盒需要保存在-80℃，不要去除覆盖膜。 |
因为IPG Runner™ Mini-Cell 槽小的占地面积，它可以在任何实验台上贮存和电泳，无需专门的IEF实验台。ZOOM® IPG RunnerTM过程的简洁性使每一个人都可以进入2D电泳技术。技能的传授和训练是简单的，将会使任何实验室的工作更加高效。 |
ZOOM® IPG Runner™系统满足了日常重复性的需求和2D电泳技术简洁性，这将允许每一个研究者在他们的实验台上就进入这项强大的技术。 |
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