离子交换色谱
洗脱方式的选择,
离子交换色谱洗脱方式有三种：一是改变缓冲液pH，使蛋白质从吸附状态变为解吸附状态。如在阴离子交换色谱中，通过降低流动相pH使吸附在柱子上的带负电荷的蛋白质带正电，从而达到解吸附，在阳离子交换色谱中则是通过升高流动相pH的方法达到解吸附；二是增加缓冲液的离子强度，将吸附强的分子从离子交换剂上替换下来；三是缓冲液pH和离子强度同时改变。无论哪一种方法，都可用阶段洗脱和梯度洗脱两种方式进行。
阶段洗脱是用几个不同pH缓冲液或几个不同盐浓度的缓冲液逐步进行洗脱。即pH和离子强度变化不连续。而在梯度洗脱中，缓冲液的洗脱能力是连续增加的，由于后者分辨率更好，因此被广泛采用。
在经典色谱中需用梯度混合器来制造线性梯度，梯度混合器是由两个容器构成，两个容器安放在同一个水平上，一个盛起始缓冲液，另一个盛含较高离子强度或不同pH的缓冲液。二者用管子相连，以保持溶液的流体静力平衡。当缓冲液从第一个容器流入柱内，第二个容器的缓冲液进入第一个容器自动补足，使缓冲液形成梯度。
现在许多中低压色谱仪器（如Waters，Pharmacia等公司的一些产品）和高效液相色谱一样可以用计算机控制双泵自动配制流动相，很容易地获得直线或非直线、连续或非连续的梯度模式，以满足不同的分离需要。
通常对线性梯度的要求是：
（1）洗脱液的总体积应足够大，一般梯度至少要四倍床体积，使分离的各个峰有较好的分辨率；
（2）梯度上限要有足够强的洗脱能力，使吸附的最紧密的物质也能够从柱子上被洗脱下来；
（3）梯度的斜率不应太大，以确保各峰能够分开，但又不应太小，以免峰形过宽甚至形成拖尾；一般认为，梯度体积越大，梯度变化越缓，则分辨率越好。
实验操作
1．填料的预处理
2．装柱
离子交换色谱不同于凝胶色谱，柱子通常较为短小，对于一般工作，通常选长度为10-40cm的柱已足够。柱的直径按照欲分物质的数量来选定。对于很复杂的混合物和进行精细分析是用细长的柱，分辨率较好；对于初步分离可用较粗、容量较大的柱。装好的柱子用起始缓冲液充分平衡后上样。
3．上样
离子交换色谱柱必须充分平衡后方可上样。上样量取决于色谱柱的交换容量，一般为交换容量的70-80%，上样体积可以不受限制。通常低浓度样品上样可达床体积的几倍到几百倍。这一点对较稀的样品极为有利，可以同时起到分离和浓缩的双重作用，可谓一举两得。但用于分析时，为了提高分辨率，上样量体积适当减小。用于离子交换色谱分离的样品溶液的离子强度和pH值必须与起始缓冲液（即流动相A液）一致，如不一致，应进行缓冲液转换，可通过透析或凝胶色谱来完成。
4．洗脱、样品收集
加样后用足够量的起始缓冲液洗涤除去不吸附的物质，然后再进行洗脱。洗脱可选择不同的方法，用控制器或梯度混合器控制梯度。流出的样品组分经紫外检测器实时检测（检测波长一般为280nm），用分部收集器或手工收集。
5．再生
样品洗脱完毕后要进行再生，以除去仍然结合在柱子上未完全洗下的一些蛋白质，通常用100%流动相B液再洗脱1个柱体积即可。
6. 平衡
再生后的柱子欲再次进样需重新进行平衡，平衡一般用100%A液（即0%B液）洗涤柱子至少四个柱体积。
7．保存
柱子不用时应用强洗脱剂洗去结合于柱子上的杂质，然后再用蒸馏水彻底清洗后加抑菌剂保存。
