离子交换色谱（二）
其他
一、离子交换剂的选择
1. 剂型的选择
在决定选择离子交换剂的类别之前，先要了解所研究的生物大分子保持生物活性和可溶解性的pH范围，然后根据其等电点以及其在上述pH范围内的电泳行为观察大分子的带电情况，再据此选择合适的离子交换剂。具体方法是；在流动相pH条件下进行电泳，向阳极泳动的蛋白质，可被阴离子交换剂吸附，因此，选择阴离子交换色谱；反之，向阴极泳动的蛋白质，可被阳离子交换剂吸附，应选择阳离子交换色谱。
通常，弱离子交换剂用来分离高静电作用力的蛋白质，强离子交换剂用来分离低静电作用力的蛋白质。
2. 粒度的选择
离子交换剂粒度的大小对吸附量的影响不大，主要是对分辨率和流速产生影响。用粗颗粒填料填充的柱子不紧密，颗粒间隙大，容易引起区带扩散；由于颗粒大，同样吸附量的粗颗粒占柱床体积大，使形成的峰变宽。这些都会导致色谱分辨率下降。但是颗粒大流速快，分离速度快，使纯化时间缩短。细颗粒填料可填充成为致密的吸附床，分辨率高，但流速慢，柱压高。我们可根据自己工作的需要进行选择，如果为保持欲分离组分的生物学活性需要缩短分离时间，在大量制备基因工程产品时，可选用粗颗粒。如果要得到高分辨率，可选用超细颗粒。通常我们在实验室工作中采用的是细或中等粗细的颗粒。
3. 缓冲液的选择
在离子交换色谱中，选择合适的缓冲体系，保持准确的流动相pH值更显得尤为关键。选择缓冲液时应满足以下要求：
（1）不破坏蛋白质的结构，不影响蛋白的活性。
（2）对人体无毒无害。
（3）缓冲容量大，在所选择pH范围内有足够缓冲能力的前提下，离子浓度越小越好。
（4）使用阳离子交换时应用阴离子缓冲剂，使用阴离子交换时应用阳离子缓冲剂，以避免不必要的离子交换过程。
（5）不干扰对分离物的鉴定。
目前阳离子交换色谱常用缓冲液离子有烷基胺、氨基乙醇胺、乙二胺、咪唑、Tris，吡啶等，其中Tris最为常用；阴离子交换色谱常用的缓冲液离子有醋酸盐、巴比妥酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸，磷酸盐等，其中醋酸盐和磷酸盐最为常用。
在实际工作中，我们根据不同的流动相 pH条件来决定采用何种缓冲体系。例如：流动相pH3-5时，我们采用甲酸铵缓冲液；流动相pH4-6时，我们采用醋酸钠或醋酸钾缓冲液；流动相pH6-8时，我们采用磷酸钠或磷酸钾缓冲液。此外，Tris-盐酸缓冲液的pH范围为7-9，Tris-磷酸缓冲液的pH范围为6-9，我们都经常选用。
4. 洗脱方式的选择
离子交换色谱洗脱方式有三种：一是改变缓冲液pH，使蛋白质从吸附状态变为解吸附状态。如在阴离子交换色谱中，通过降低流动相pH使吸附在柱子上的带负电荷的蛋白质带正电，从而达到解吸附，在阳离子交换色谱中则是通过升高流动相pH的方法达到解吸附；二是增加缓冲液的离子强度，将吸附强的分子从离子交换剂上替换下来；三是缓冲液pH和离子强度同时改变。无论哪一种方法，都可用阶段洗脱和梯度洗脱两种方式进行。
阶段洗脱是用几个不同pH缓冲液或几个不同盐浓度的缓冲液逐步进行洗脱。即pH和离子强度变化不连续。而在梯度洗脱中，缓冲液的洗脱能力是连续增加的，由于后者分辨率更好，因此被广泛采用。
在经典色谱中需用梯度混合器来制造线性梯度，梯度混合器是由两个容器构成，两个容器安放在同一个水平上，一个盛起始缓冲液，另一个盛含较高离子强度或不同pH的缓冲液。二者用管子相连，以保持溶液的流体静力平衡。当缓冲液从第一个容器流入柱内，第二个容器的缓冲液进入第一个容器自动补足，使缓冲液形成梯度。
现在许多中低压色谱仪器（如Waters，Pharmacia等公司的一些产品）和高效液相色谱一样可以用计算机控制双泵自动配制流动相，很容易地获得直线或非直线、连续或非连续的梯度模式，以满足不同的分离需要。
通常对线性梯度的要求是：
（1）洗脱液的总体积应足够大，一般梯度至少要四倍床体积，使分离的各个峰有较好的分辨率；
（2）梯度上限要有足够强的洗脱能力，使吸附的最紧密的物质也能够从柱子上被洗脱下来；
（3）梯度的斜率不应太大，以确保各峰能够分开，但又不应太小，以免峰形过宽甚至形成拖尾；一般认为，梯度体积越大，梯度变化越缓，则分辨率越好。
二、实验操作
1. 填料的预处理
2. 装柱
离子交换色谱不同于凝胶色谱，柱子通常较为短小，对于一般工作，通常选长度为10-40cm的柱已足够。柱的直径按照欲分物质的数量来选定。对于很复杂的混合物和进行精细分析是用细长的柱，分辨率较好；对于初步分离可用较粗、容量较大的柱。装好的柱子用起始缓冲液充分平衡后上样。
3. 上样
离子交换色谱柱必须充分平衡后方可上样。上样量取决于色谱柱的交换容量，一般为交换容量的70-80%，上样体积可以不受限制。通常低浓度样品上样可达床体积的几倍到几百倍。这一点对较稀的样品极为有利，可以同时起到分离和浓缩的双重作用，可谓一举两得。但用于分析时，为了提高分辨率，上样量体积适当减小。用于离子交换色谱分离的样品溶液的离子强度和pH值必须与起始缓冲液（即流动相A液）一致，如不一致，应进行缓冲液转换，可通过透析或凝胶色谱来完成。
4. 洗脱、样品收集
加样后用足够量的起始缓冲液洗涤除去不吸附的物质，然后再进行洗脱。洗脱可选择不同的方法，用控制器或梯度混合器控制梯度。流出的样品组分经紫外检测器实时检测（检测波长一般为280 nm），用分部收集器或手工收集。
5. 再生
样品洗脱完毕后要进行再生，以除去仍然结合在柱子上未完全洗下的一些蛋白质，通常用100%流动相B液再洗脱1个柱体积即可。
6. 平衡
再生后的柱子欲再次进样需重新进行平衡，平衡一般用100%A液（即0%B液）洗涤柱子至少四个柱体积。
7. 保存
柱子不用时应用强洗脱剂洗去结合于柱子上的杂质，然后再用蒸馏水彻底清洗后加抑菌剂保存。
