免疫亲和柱荧光分光光度法检测分析黄曲霉毒素
黄曲霉毒素免疫亲和柱-高效液相色谱法比传统的 HPLC 法更加安全、可靠、灵敏度和准确度高。它采用单克隆抗体免疫技术可以特效性地将黄曲霉毒素或其他真菌毒素分离出来,分离效率和回收率高。
分析原理
试样中的黄曲霉毒素用一定比例的甲醇/水提取,提取液经过过滤、稀释后,用免疫亲和柱净化,以甲醇将亲和柱上的黄曲霉毒素淋洗下来,在淋洗液中加入溴溶液衍生,以提高测定灵敏度,然后用荧光分光光度计进行定量。也可以将甲醇-黄曲霉毒素淋洗液的一部分注入 HPLC 中,对黄曲霉毒素 B1,B2,G1,G2 分别进行定量分析。免疫亲和柱是用大剂量的黄曲霉毒素单克隆抗体固化在水不溶性的载体上,然后装柱而成。该方法的测定范围0～300μg/kg。
分析仪器及试剂
4系列真菌毒素专用荧光分析仪。
黄曲霉毒素免疫亲和柱。
0.03%的溴溶液。
荧光分析仪校准溶液:称取3.40g 二水硫酸奎宁,用0.05mol/L 的稀硫酸稀释至100mL。
氯化钠(分析纯)。
甲醇(色谱级)。
二次蒸馏水。
1.5μm的玻璃纤维滤纸。
测定步骤
①试验准备
a.标定荧光计。
b.配制0.003%溴衍生溶液(一天配制一次):取5mL 0.03%的溴溶液,加入45mL 的纯水。
c.配制甲醇:水(60:40体积比)溶液。
d.试剂空白试验(1mL甲醇+1mL 0.003%溴衍生液置于测试管中),荧光计读数应为0。
e.纯水空白试验(2mL 纯水置于测试管中),荧光计读数应为0。
②样品提取
a.称取25g 磨细的样品(液体样品直接称取),5g 氯化钠,置于搅拌杯中。
b.加入125mL 甲醇:水(60+40)溶液。
c.盖上搅拌杯的盖子,高速搅拌1min。
d.取下盖子,将提取物倒入折叠式滤纸上,滤液收集于干净的容器中。
③提取物的稀释
a.移取20mL 上步的滤液,置于干净的容器中。
b.用20mL 纯水将滤液稀释,混匀。
c.将上步稀释液通过玻璃纤维滤纸,滤液收集于玻璃注射器筒中,量取10mL ④亲和柱色谱操作。
a.将上步10mL 滤液(10mL 相当于1.0g 的样品),以1～2滴/秒的流速全部通过AflaTest-P亲和柱,直至空气进入到亲和柱中。
b.将10mL 纯水以2滴/秒的流速通过亲和柱。
c.将10mL纯水以2滴/秒的流速再次通过亲和柱,直至空气进入到亲和柱中。
d.用1.0mL HPLC 级的甲醇以1～2滴/秒的流速淋洗亲和柱,将所有样品淋洗液(1mL)收集于玻璃测试管中。将1.0mL 0.003%溴衍生溶液加到测试管的淋洗液中,混匀。
⑤用荧光光度计测定将制备好样液的测试管置于已标定好了的荧光计中。60s 后读数,测定结果为 B1+B2+G1+G2 总量。
⑥用 HPLC 进行测定
a.从第四步1mL 的甲醇-黄曲霉毒素洗脱液取100μL,直接注入 HPLC 中,即可得到如图所示的谱图,然后可分别测定出黄曲霉毒素 B1,B2,G1,G2 的含量。
b.HPLC 的工作条件
柱:反相 C18(Waters Nova pak C18,5mm×100 mm,4μm cartridge,Whatman Partisphere RTF C18,4.6mm×150mm或者 Merck C18 column,5mm×12.5cm,5μm)。
流动相:甲醇:水(45:55)脱气。
流速:0.8 mL/min。
荧光检测器:激发波长360nm,发射波长440nm。
后置柱衍生液:0.05%碘溶液。
流速:0.2mL/min。
反应温度:70℃(恒温箱的温度)。
反应时间:1min。
