免疫亲和柱净化荧光法测定黄曲霉毒素M1
1、黄曲霉毒素 M1 简述
黄曲霉毒素 M1 是动物摄入黄曲霉毒素B1后在体内经羟基化代谢的产物,一部分从尿和乳汁排出,一部分存在于动物的可食部分,如乳、肝、蛋类、肾、血和肌肉中,其中以乳最为常见,且乳和乳制品中的黄曲霉毒素 M1在生产和贮藏期间相对稳定,不被巴氏消毒破坏。用含有黄曲霉毒素 B1100μg/kg 的饲料喂牛,牛乳中含有黄曲霉毒素 M1 约为1μg/kg。黄曲霉毒素 M1 的毒性和致癌性与黄曲霉毒素 B1 的基本相似。由于牛乳及其制品是人类、特别是婴儿的主要食品,因此各国对其限量的要求十分严格,一些国家规定牛奶及奶制品中黄曲霉毒素 M1 的含量不得超过0.5μg/kg,而欧盟的规定更加严格为0.05μg/kg。下面介绍的是免疫亲和柱净化荧光计测定测定牛奶和奶粉中黄曲霉毒素 M1 含量。
2、免疫亲和柱净化荧光计快速测定法
(1)测定原理
试样经过离心、脱脂、过滤后,滤液经过键合有黄曲霉毒素 M1 特殊抗体的免疫亲和柱净化,此抗体对黄曲霉毒素 M1 具有专一识别能力,黄曲霉毒素 M1 键合在分离柱中的抗体上。用甲醇/水(10+90)将免疫亲和柱上杂质除去,以甲醇/水(80+20)通过分离柱洗脱,加入溴溶液衍生,以提高测定灵敏度。衍生化后的洗脱液于荧光光度计中测定黄曲霉毒素 M1。
(2)仪器设备与试剂
甲醇(CH3OH):液相色谱级纯。
氯化钠(NaCl)。
溴储备液(0.01%):称取适量溴,溶于水,配成0.01%的储备液,避光保存。
溴水使用液(0.002%):取10mL 0.01%的溴溶液加入40mL 水混匀,于棕色瓶中保存备用。需现用现配。
硫酸溶液(0.05mol/L):取2.8mL 浓硫酸,缓慢加入适量水中,冷却后定容至1000mL。
荧光光度计校准溶液:称取0.340g 硫酸奎宁(C20H24N2O2·H2SO4·2H2O)用0.05mol/L 硫酸溶液稀释至100mL,此溶液相当于2ng/g 黄曲霉毒素M1标准溶液,0.05mol/L硫酸溶液相当于0ng/g 黄曲霉毒素M1。
真菌毒素专用荧光分析仪。
离心机(离心力大于2000g)。
玻璃纤维滤纸(直径11cm,孔径1.5m)。
免疫亲和柱:内含单株抗体对黄曲霉毒素M1具有专一性。
空气压力泵。
玻璃试管(12mm×75mm,无荧光特性)。
(3)分析步骤
①样品提取
量取50mL 牛奶样品,加入1.0g 氯化钠,在离心机上以2000g 离心10min,小心仔细地将用于牛奶分析的有效部分(低层)移取,不要扰动顶部脂肪层(可以这样进行操作:用注射器针头将塑料离心管的底部戳一个洞,让底层分离下来),将脱脂的牛奶以玻璃纤维滤纸过滤。
②净化
将免疫亲和柱连接于10mL 玻璃针筒下。准确移取10.0mL 上述澄清液注入玻璃针筒中,将空气压力泵与针筒连接,调节压力使溶液以约6mL/min 流速缓慢通过免疫亲和柱,直至2～3mL 空气通过柱体。以10mL 甲醇/水(10+90)清洗柱子2次,弃去全部流出液,并使2～3mL 空气通过柱体。准确加入1.0mL 甲醇/水(80+20)洗脱,流速为1～2mL/min,收集洗脱液于玻璃试管中,供检测用。
③测定
荧光光度计校准在激发波长360nm,发射波长450nm 条件下,以0.05mol/L 硫酸溶液为空白,调节荧光光度计的荧光强度值读数为0.0;以校准溶液调节荧光光度计的荧光强度值读数为2.0。
样液测定取上述洗脱液加入1.0mL 0.02%溴溶液,于荧光光度计中测定黄曲霉毒素M1含量。
④结果计算 荧光光度计测定结果按下列公式计算:
式中X——试样中黄曲霉毒素M1含量,ng/g;
c——荧光光度计中读取的样液中黄曲霉毒素M1的浓度,ng/mL;
V——样液最终定容体积,mL;
m——最终样液所代表的试样量,g。
(注:计算结果需扣除空白值。)
