蛋白质免疫印迹实验组织蛋白提取
组织蛋白提取
1）所需器材：制冰机、标记笔、两套1.5ml EP管（最好高温高压处理）、一个大冰盒、一个1.5ml EP管盒、手套、眼科剪（最好高温高压处理）、新鲜组织或保存于-80℃冰箱组织、保存于4℃冰箱的PBS（最好高温高压处理）、移液枪、吸头（最好高温高压处理）、两套研磨棒（最好高温高压处理）、掌上离心机、滤纸、三去污裂解液、苯甲基磺酸氟（PMSF，一种蛋白酶抑制剂，剧毒）、离心机、烧杯、2×SDS凝胶上样缓冲液、二硫苏糖醇（DTT）、震荡器、泡沫板。
2）操作步骤：
a.制冰机制冰；
b.标记笔将两套EP管做好标记；
c.将大冰盒、EP管盒装上冰，一套标记笔做好标记的EP管放置于大冰盒中，另一套标记笔做好标记的EP管放置于EP管盒中，戴好手套，带上EP管盒、眼科剪剪取黄豆大小（约100mg）新鲜组织或保存于-80℃冰箱组织；
d.取出保存于4℃冰箱的PBS，往EP管中滴加1ml PBS，眼科剪剪碎组织（动作快），掌上离心，弃上清，再往EP管中滴加1ml PBS，研磨棒研磨，3000转离心10分钟，弃上清，滤纸尽可能吸干管口残留液体，估算EP管中沉淀物体积，以上步骤尽可能在冰上操作；
e.从4℃冰箱取出三去污裂解液，-20℃冰箱中取出PMSF置于大冰盒中，往EP管中滴加沉淀物3-5倍体积的三去污裂解液（一般为5倍）,再加入PMSF（二者比例为94：6）,研磨棒研磨（冰上充分裂解20-30分钟），以上步骤均需在进行；
f.离心机预冷，将充分裂解后的组织液4 ℃、10000转离心10分钟；
g.将烧杯用自来水洗净，倒入单蒸水，电炉上煮沸；
h.备好2×SDS凝胶加样缓冲液（存放于常温），取出保存于-20℃冰箱的DTT,置于大冰盒中，将离心后的上清液用移液枪定量吸至另一套EP管中（勿吸取下层沉淀物），按上清液：2×SDS：DTT =1: 0.8:0.2加入2×SDS 及DTT，掌上离心，然后小心将EP管插入泡沫板，投入已煮沸的烧杯中煮6-8分钟（电炉功率不要调太大，以免管盖爆开）；
i. 将泡沫板用镊子取出，置大冰盒中冷却10分钟，掌上离心，再放入-20℃冰箱保存备用。
