脂质与蛋白质“双剑合璧”，助力微生物鉴定与药敏检测
文献速递：《基于常规MALDI-TOF MS进行物种特异性脂类检测技术将开启微生物鉴定与药敏检测的新纪元》
微生物质谱的发展日新月异，近期布鲁克高级研发总监Markus Kostrzewa与英国帝国理工大学合作撰写了一篇文献综述，展望了负离子模式下的脂类质谱分析与蛋白质指纹图谱联合使用，将有助于解决目前微生物质谱的一些限制，脂质分析可以提供亚种水平的鉴定和抗菌药物敏感性信息，进一步扩大其在临床诊断和微生物学研究中的应用。
基于蛋白质分析的MALDI-TOF微生物鉴定
MALDI-TOF MS基于蛋白特征图谱，仅需一个小菌落即可为广泛微生物提供了快速、准确和低成本的鉴定检测，已广泛应用于临床微生物鉴定。但同时存在一些局限之处急需解决：1，对于具备复杂厚实细胞壁中的微生物，需要耗时费力的蛋白质提取程序，如分枝杆菌和部分真菌需要较为复杂的蛋白提取程序。2，无法区分一些近缘微生物，如志贺氏菌属和大肠埃希氏菌，缓症链球菌和肺炎链球菌，支气管炎博德特菌和百日咳博德特菌，阴沟肠杆菌复合群，结核分枝杆菌复合群，脓肿分枝杆菌复合群等。
脂类作为物种特异性的生物标志物
脂质是细胞的主要功能和结构成分，微生物细胞含有多种脂质分子，这些分子在主链和端基的性质、脂肪酸的数量以及化学修饰方面有所不同，这些多样性使它们具备成为微生物鉴定有用生物标志物的潜力,如：
革兰氏阴性细菌 Orskov报道使用脂多糖（LPS）的成分之一O抗原用于沙门氏菌和大肠杆菌的血清分型；Casabuono等人报告过福氏志贺氏菌X变异株中脂质A的结构特征，可用于区分志贺氏菌和大肠埃希氏菌。
分枝杆菌 中结构多样性的分枝菌酸，仅在结核分枝杆菌中发现的硫酯1和多环海藻糖，仅在非结核分枝杆菌中发现的海藻糖多倍体都有可能用于分类标记。
MALDI-TOF脂质图谱应用于微生物鉴定
以9-氨基吖啶（9-AA）作为基质，无需脂质提取，直接用完整冻干的细菌膜精细研磨粉碎，将得到的颗粒加样至MALDI靶板上并进行分析，能直接鉴定极端嗜盐古细菌-盐沼盐杆菌。而 Larrouy-Maumus等人研发出了一种新的方法。使MALDI-TOF可以直接分析完整微生物脂质，样品不需要任何化学处理或纯化。只需将热灭活的微生物用双蒸馏水洗涤三次，加样在MALDI靶板上，然后加入特定的MALDI基质即可进行分析。该基质为9：1的二羟基苯甲酸和2-羟基-5-甲氧基苯甲酸（super-DHB）混合后溶解于无极性溶剂中。迄今为止，该方法已被用于鉴定分枝杆菌、丝状真菌和从革兰氏阴性菌中检测脂质A 。
MALDI-TOF 脂质分析应用于细菌药敏测试
MALDI-TOF MS脂质分析应用于细菌药敏主要有以下研究进展：
粘菌素耐药性检测的MALDIxin试验，Dortet等人将完整的细菌或温和酸水解产生的细菌裂解物（乙酸1%）在MALDI靶板上与特定基质混合，然后在负离子模式下进行MALDI-TOF MS 分析，获得的质谱图根据主要脂质A峰的质荷比（m/z）来区分粘菌素敏感菌和粘菌素耐药菌。在脂质A位置1处的磷酸基团中加入pETN会导致天然脂质A相关峰发生m/z +123位移，而L-Ara4N修饰会导致m/z +131位移。该试验还可以区分耐药是染色体突变耐药还是质粒介导的MCR耐药，因为L-Ara4N修饰通常在具有染色体突变导致的耐药菌株中检出，而pETN修饰在表达MCR的菌株中占主导地位。该方法可在15分钟内完成对临床分离的大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌和肠炎沙门菌的粘菌素耐药性检测，目前已被加入MALDI Biotyper Sirius系统。
MRSA/MSSA MOLI MS脂肪酸分析，Saichek等人利用来研究鉴别耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)和甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA) 菌株，研究发现两者在脂肪酸组成上存在差异，MSSA中奇数脂肪酸的含量更高，MRSA中偶数脂肪酸的含量更高。
MALDI与傅里叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICRMS) 联用，Schenk等人研究了大肠埃希菌菌株在接触亚致死浓度诺氟沙星（一种氟喹诺酮类抗生素）时，其变性脂肪酸和甘油磷脂的分布。研究结果表明菌株中脂质含量的变化与抗生素耐药程度有相关性。此研究方法为脂类分析用于更广法的抗生素敏感性测试提供了依据，但需要进一步的研究来确认耐药性、膜组成的变化和不同类脂的相对含量之间的相关性，从而确保MALDI-TOF MS系统开展常规药物敏感性试验的准确性和稳定性。
结论与展望
脂质组学在临床微生物学中的应用由于初始方法的工作量大、时间长的关系而滞后于蛋白质组学的应用。然而新的MALDI-TOF MS脂质分析方法在过去的十年中已经被开发出来，该方法能够以与常规微生物质谱分析相媲美的速度和准确性来鉴定微生物。尤其是对于完整细菌和丝状真菌样品制备，变得更加简单和快速。鉴于这些进展，脂类质谱分析有可能与蛋白质指纹图谱联合使用，有助于解决目前微生物质谱的一些限制，从而进一步扩大其在临床诊断和其他常规微生物学研究中的应用。如图1中工作流程所示，将实现在同一MALDI靶板上结合脂质和蛋白质分析。这种方法可以在一次测试中实现几个检测目标：蛋白质指纹图谱实现微生物种水平上的鉴定，而脂质分析可以提供亚种水平的鉴定和检测抗菌药物敏感性。
尽管在优化样品制备方面取得了相当大的进展，但还需要进一步开发相关的生物信息学资源，使脂质分析在临床诊断领域中更便于用户使用，这包括建立可靠和准确的数据库。开发出一个具有代表性的，在大小和品种上能与目前商品化系统蛋白质质谱库相媲美的脂质数据库，将提高微生物鉴定的效率。
在未来，脂质分析可能会扩展到检测除粘菌素之外其他抗生素的耐药性。多篇论文报道了耐药菌株的脂质成分发生改变，如利福平耐药的结核分枝杆菌和达普霉素耐药的粪肠球菌。通过检测这些改变及其相对含量，脂质分析可能用于识别耐药微生物。然而这需要大规模分析脂质组成，如果手工进行试验，将是一个高度复杂的任务，为了完善数据分析，后续还需开发机器自主学习技术以区分抗生素耐药和敏感菌株的质谱才能得以实现。
图1 结合脂质和蛋白分析，MALDI Biotyper sirius微生物质谱的工作流程示意图
文献来源：《Detection of Species-Specific Lipids by Routine MALDI TOF Mass Spectrometry to Unlock the Challenges of Microbial Identification and Antimicrobial Susceptibility Testing. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 》Published:04 February 2021 dol:10.3389/fcimb.2020.621.452
