关于食品中大肠杆菌检测方法的研究
摘 要：随着人们生活水平的提高，食品安全问题受到越来越多的重视，在不断被报道的食品安全事故中，大肠杆菌是引起这些事件的主要的影响因素之一，是判断食品污染程度的一个重要参数，因此采用快速、可靠、简便的方法来准确检测食品中大肠杆菌数量是否超标是至关重要的。本文综述了大肠杆菌的传统检测方法以及最新的检测方法，为食品中大肠杆菌的检测提供参考。
大肠杆菌是人和动物肠道中最著名的一种细菌，主要寄生于大肠内，约占肠道菌中的1%，是一种两端钝圆、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。大肠杆菌能合成维生素B和K，正常栖居条件下不会致病；若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在水和食品中检出，可认为是被粪便污染的指标。大肠菌群数常作为饮水、食物或药物的卫生学标准。大肠杆菌是国际上公认的卫生监测指示茵，因此大肠杆菌的检测技术显得十分重要，相应出现了大量的大肠杆菌的各种检测方法[1-2]。以下综述了一些常用的大肠杆菌检测的传统方法以及最近出现的新的检测方法，为以后大肠杆菌检测技术的发展提供一些参考。
1 大肠杆菌检测的传统方法
1.1 多管发酵法
多管发酵法是一种检测水体中大肠杆菌的传统方法，这种方法是在44.5℃的含有荧光底物的培养基上连续培养24h，而后能产生分解荧光底物――葡萄糖醛酸酶，从而释放出荧光产物，进而使培养基在紫外光照射下产生特征荧光。此方法可被用来对原样品中的菌落数作统计学估计。一般涉及以下试验：首先是发酵，在单料或双料乳糖胆盐发酵管内发酵；然后是分离培养试验，利用伊红美蓝培养皿分离；接着是在乳糖发酵管中进行二次发酵，最后通过芽孢染色、革兰氏染色、显微镜观察等来完成。多管发酵法对试验条件要求不高，成本低，但是检测时间较长，容易受其他条件干扰，进而影响到测定结果的精确度。
1.2 滤膜法
该方法基本步骤是：首先于滤器内加入约10mL无菌稀释水，接着将适量充分混匀的待检食品的水溶液加入滤器中，进行抽滤，快滤完前加少许无菌稀释水以冲洗滤器内壁，使水溶液内的细菌全部集中于滤膜上；用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在M-FC培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜与培养基完全紧贴不能有气泡，将培养皿紧密盖好后，置于能准确恒温于44.5±0.5℃的恒温培养箱中，经24±2h培养，粪大肠菌群呈蓝色或蓝绿色，计数此类菌落数目。对于疑难的菌落，将可疑菌落接种于EC培养液，44.5±0.5℃培养24±2h后观察是否产气，以确定此类可疑菌落是否为粪大肠菌群细菌。然后计算每升水样中粪大肠菌群数的近似值，最终换算成食品中所含大肠杆菌的数目。
1.3 平板计数法
平板法无菌操作用无菌吸管各吸取1mL与乳糖胆盐发酵法相同稀释度的样液，移入无菌培养皿中，将冷至45℃的COLI ID选择性显色培养基约10mL注入培养皿内，并迅速转动培养皿，混合均匀，待凝固后，再次将冷至45℃的培养基约5mL注入培养皿内，并迅速摇开使之覆盖平板表层，待凝固后，翻转培养皿置37℃培养24h后观察菌落颜色与形态，计数。每稀释度平行做2个培养皿。该方法是将样本做一定比例的稀释，其中的微生物被稀释后分散成单个细胞，然后在一定的条件下进行培养一直到生长成能用肉眼观察的菌落，最后通过样本数量和稀释度来计算出单位样本中的菌数。
2 大肠杆菌检测的新技术
2.1 气相色谱（GC）和高效液相色谱法（HPLC）
气相色谱法主要是将大肠杆菌经过一系列衍生化的前处理后，为接下来的分析研究提供尽可能多的化学组分。大肠杆菌的污染程度可以用顶空气相色谱法来分析，其原理是利用食品密封系统顶部的微生物代谢产物CO2对微生物进行分析。这种方法对食品质量安全检测有重大意义。与上述传统技术相比，此种方法具有检测速度快、灵敏度高的优点。高效液相色谱法（HPLC）主要是根据离子配对反相层析的原理来分析核酸。HPLC主要是针对DNA片段分离。长链DNA所携带的磷酸基团比较多，因此会有更多的TEAA与之相融合，其在柱内停留的时间增加。因为乙腈具有亲水性，可以通过其而将DNA分离，在具备一定的变性温度下，可以通过图谱显示明显的吸收峰。该技术具有准确度高、灵敏度高、成本低等优点，可大大提高工作效率。
2.2 ATP生物发光技术
ATP生物发光技术是近些年来发展较快的微生物快速检测方法。ATP是活细胞中最普遍的能量代谢产物，为细胞提供各种生理活动所需的能量，而且其在生物体内含量维持在一定的范围内。ATP含量检测的一种方法是荧光光度法，生物发光是活细胞在荧光素酶催化下发出的荧光。目前使用的荧光素酶主要来源于北美的萤火虫，相对分子质量为62000的蛋白质，它可以催化荧光素的氧化反应，这种反应的终产物不稳定，很快分解产生荧光。与传统检测方法相比，不同之处在于几分钟内便可获得检测结果，而且荧光光度计是便携式的，使用非常方便，适用于现场检测，这种技术可以用于检测微小的污染物水平以及食品加工设备及其表面的清洁程度的检测。
2.3 PCR检测技术 [3-5]
聚合酶链反应技术即P C R（polymerase chain reaction），该技术是在1971年首先被Kleppe等提出，1985年才作为一种检测方法获得认可。PCR检测技术是一种聚合酶链反应，其采用变性―退火―延伸三个步骤使DNA基因能够在体外实现解旋解链，类似于一种体外增加、复制形式。理论上可在2h内将一个DNA分子扩增到106～109倍，采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的荧光条带。
目前PCR技术广泛用于生命科学的许多学科中。在食品微生物检测领域，PCR可用于快速检测食品中的微生物含量。常用的主要有免疫PCR、实时荧光定量PCR、多重PCR、反转录PCR和实时定量PCR等。史云等建立了用于肉及肉制品中大肠杆菌的两重PCR检测方法，但该方法需要较长的时间的样品纯化处理，且对操作人员的专业知识的要求也较高。 2.4 生物传感器检测技术[6-7]
生物传感器主要是以生物化学传感技术为基础，用抗体、酶、细胞等作为识别元件，并与信号转换器和电子测量仪联合构成的一种分析工具。目前已经成熟的商品化的传感器有免疫传感器、酶传感器、DNA杂交传感器、微生物传感器、分子印迹传感器等。生物传感器具有诸多优点，如高灵敏度、高选择性、较好的稳定性、低成本、且能在复杂的体系中快速在线监测。现在用于信号传导的方法有表面声波传导、电气化学方法和光学传导法。用于食品微生物检测的主要是免疫传感器和基因传感器，原理是利用DNA杂交和抗原抗体反应进行检测，再将其转换为光信号或电信号并通过仪器放大输出。生物传感器的分子识别元件的载体可采用多种材料，利用较多的是光纤、荧光光度计等。殷涌光等人利用抗体免疫吸附反应，采用一次抗体――抗原一二次抗体的夹心法将胶体金复合抗体作为二次抗体大幅度增加质量，并延长胶体金复合抗体与微生物的结合过程，放大和稳定信号，从而显著提高检测精度。
2.5 免疫磁珠技术（IMS）
免疫磁珠技术是一种大肠杆菌的分离技术。其原理是以磁珠为抗体载体，磁珠和大肠杆菌结合，通过磁力来实现力学移动进而将大肠杆菌进行分离。与其他的细菌分离方法相比，免疫磁珠技术在很大程度上提高了样本中病原性副溶血性弧菌的检测效率。免疫磁珠技术可以快速地在不同菌种的样本中处理不同的微生物，该方法可以大幅度地提升检测效率。
2.6 自动化仪器
自动免疫测定分析仪诞生于20世纪70年代。随着科技的发展，自动免疫测定分析仪在各领域的应用也越来越多，该仪器使用简单，无太多操作干扰，既省时省力，又大大提高了检测的精确度和灵敏度。这种自动酶标免疫测试系统目前在国内外是酶免疫自动化系统中应用最为广泛的一种。但是由于与其配套的试剂昂贵，从而限制了其在基层实验室的使用。
2.7 基因芯片技术
基因芯片技术（gene chip）是20世纪90年代兴起的生物技术，也叫DNA微阵列（DNA mi―croarray）。采用原位合成（in situ synthesis）或显微打印方法，将数以万计的DNA探针固化在支持物表面，产生二维DNA探针阵列，接着与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效地检测，由于它常用硅芯片作为固相支持物，而且制备中运用了计算机芯片的制备技术，所以称为基因芯片技术。基因芯片可以对食品中的致病菌实行高通量和平行检测，一次实验就可以得出全部检测结果。另外整个检测在很短时间内即可得出检测结果，且敏感性高，特异性强。但是也有一些问题：目前的基因芯片一般都采用荧光标记，因此需要昂贵的芯片制作系统以及激光共聚焦扫描仪，另外操作过程对工作人员要求有很高的专业素质等等。所以基因芯片的制备技术限制其应用而且还需改进。
结语
近年来，世界各国针对水环境和食品中大肠杆菌的快速检测技术展开了大量研究，本文综述了近年来常用的一些检测方法，每种方法都有自己的优势以及不足之处。随着科学和生物化学技术的不断进步，对食品中大肠杆菌的检测精度和速度提出了更高的要求，我们只有不断的改进以及完善相关的检测技术，才能适应时代的要求，才能切实的解决食品安全问题，为人类的生活提供有力保障。
参考文献
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