抗血清的制备（二）
3、免疫途径，剂量和免疫周期
抗原注射途径可根据不同抗原及试验要求，选用皮内、皮下、肌肉、静脉或淋巴结内等不同途径注入抗原进行免疫。一般常采用背部、足掌、淋巴结周围、耳后等处皮内或皮下多点注射。初次免疫与第二次免疫的间隔时间多为2～4周。常规免疫方案为抗原加CFA皮下多点注射进行基础免疫；再以免疫原加IFA作2～5次加强免疫，每次间隔2～3周，皮下或腹腔注射加强免疫。
1）常规（皮内多点注射）免疫：
1第一次免疫：剂量为每只兔子注射1.0 ml抗原乳剂（含抗原量1～2mg）。注射部位为两只后脚掌的皮内各注射0.2 ml，其余0.6
ml分多点注入脊柱二侧，颈部，腹股沟和腋窝等处淋巴结附近部位皮内，每点可注入0.05ml，分12点注入。
2第二次免疫：初次免疫后20天左右，剂量为1.0ml/只（1～2 mg/ml），加福氏不完全佐剂。注射部位在腹部皮下多点注射，每点注入0.1 ml。
3第三次免疫：再次免疫后两周内进行，注射剂量和部位同第二次免疫，免疫后7～14d抽取少许静脉血，分离血清，试血测定效价。
2）淋巴结免疫：主要优点是可减少抗原用量。过程如下：
1卡价苗致敏：免疫前足掌皮下每侧各注入活卡价苗（75 mg/ml）0.3 ml。10天左右观察两侧腘窝淋巴结，一般可肿胀如蚕豆大小，此时即可进行淋巴结内免疫注射。
2第一次免疫：用手指定淋巴结后在两侧腘窝淋巴结内各注入抗原乳剂0.25ml，每只兔总量0.5 ml；为加强免疫，于初次免疫20天后，于腹部皮下多点注射不加佐剂抗原溶液1mg/1ml。
3二周后可如同第一次免疫的剂量和途径再注射一次，一般可在第三次免疫注射前试血滴定效价，效价如已达到要求可不必进行第三次免疫。
有条件的情况下，免疫后要加强动物饲料管理，如给熟黄豆饲养等。
3）腹腔免疫：一般不必加佐剂，适用于细胞性或颗粒性抗原，而且抗原性较强者，例如用绵羊红细胞免疫家兔或小鼠即可用此法。
4、试血，测定抗体效价
一般在第三次免疫后7～10天即可于兔耳静脉或小鼠尾尖取少量血，分离出血清之后进行试血。
① 环状试验，较为经典的方法，目前较少采用，如与20μg/ml以下的抗原于30 min内能出现“艹”的沉淀环，即测定抗体效价达1：5000以上时为合格。
② 免疫双扩散法，这是最常用的试血方法，其具体方法是，中间孔加稀释的抗原（1mg/ml）10μl，周围孔顺时针方向加制备的抗血清分别为1:2, 1:4,
1:8，1:16，1:32和1:64，（用生理盐水或PBS稀释）。经37℃保温24h后观察结果，效价在1:16以上即可决定放血。
5、放血
经效价检查合格后即可放血。放血前动物应停食12
h，以减少血清中的脂肪含量。如拟保留该免疫动物，可直接由心脏取血，或切开耳缘静脉滴血或心脏穿刺取血。取血后由静脉缓缓注入等量5%葡萄溶液以补足失血量。取血的动物经2～3个月休息，可再次加强免疫后取血。如拟一次放血致死，可用颈动脉放血的方法，各种取血方法如下。
1）心脏取血：固定动物于仰卧位置，用食指探明心脏博动量高部位（在胸骨左侧，由下向上数第3与第4助骨之间，指兔），剪去少许毛，用2.5%
碘酒和75%酒精消毒后，以9#针头在预定位置与胸部呈45。角刺入心脏，微微上下移动针头，待见血液进入针筒后，即将注射器位置固定取血。2.5公斤体重的家兔一次可取血20～30ml。
2）耳缘静脉滴血：先将耳缘静脉附近的毛剪去用无菌棉球将皮肤擦干净（不用酒精消毒，避免溶血）。用台灯照射耳部使血管因温度增高而扩张，然后用无菌刀片将耳缘静脉切一长0.5cm的纵切口，第一次切口应从耳尖部开始，以后再切时，逐步向耳根方向移动。用无菌试管或平皿收集流出的血液。如切口凝血，血流不畅时，可用无菌棉棒轻轻将切口外血凝块擦去（注意勿使切口损伤太大），血流仍可继续流出，直至达到所需要的血量为止。取血后用无菌棉球压迫切口止血。耳缘静脉取血一次可取血50ml左右而动物不死。
3）颈动脉放血：使动物仰卧固定四肢，颈部剪毛、消毒后纵向切开前颈部皮肤长约10cm，用止血钳将皮肤分开夹住，剥离皮下组织，露出肌层，用刀柄加以分离，即见搏动的颈动脉。小心将颈动脉和迷走神经剥离长约5cm，选择血管中段，用止血钳夹住血管壁周围的筋膜。远心端用丝线结扎，近心端用动脉钳夹住，用酒精棉花球消毒血管周围，用无菌剪刀剪一V形缺口。取长2.5cm、直径为1.6mm塑料管一段，将一端剪成针头样斜面，并将此端插入颈动脉中，另一端放入200ml无菌三角瓶内，然后放开止血钳，血即流入三角瓶内，动物流血至死，2.5公斤家兔可放血80～100ml。
6、分离血清
必须在无菌条件下进行，待收集于平皿或三角瓶内的血液凝固之后，用无菌滴管在无菌环境（例如超净工作台）中把血块与瓶壁剥离后，放入37℃，1～2h取出后放入4℃过夜，使血清充分析出（不能冰冻，否则产生溶血），经离心沉淀分出血清，放进低温冰箱保存。使用前必须经过签定合格后再分装保存备用。
7、抗血清的保存
1）经签定合格后的抗血清，以1:100比例加入1%的硫柳汞或5%的叠氮钠，使其最后浓度分别为0.01%或0.05%。
2）用无菌滴管将抗血清分装小管，每管装1ml左右。
3）-20℃以下保存，可保存2年以上。
4）如有条件可将血清冷冻干燥保存于4℃以下，保存时间更久
五、注意事项
1、动物的免疫反应存在着个体差异，甚至有人报告不同品种动物一次免疫后产生的抗体的差别可高达500倍，所以制备抗血清时不能只免疫一只动物，一般最好免疫3～4只，因为有的动物可能产生抗体效价很低或不产生抗体，免疫反应好的动物所能提供的抗体往往高于一般动物3～4倍。
2、为制备单价特异性高的抗血清，所用抗原纯度越高越好，因此，在纯化抗原过程中应尽量除去可能存在的杂蛋白，这样可以省去许多时间来吸收抗血清中的非特异性抗体。
3、要制备高效价的抗体，必须要加佐剂（一般采用完全福氏佐剂），加佐剂后免疫动物，抗体效价至少可增加5倍。但也应考虑到，如果抗原中有微量的杂蛋白存在，即使0.005mg，亦可因有佐剂而产生非特异性的抗体，所以要根据实验需要和抗原的纯度适当地使用佐剂。
4、制成的抗原乳剂是否为油包水乳剂应进行检查，否则会影响免疫效果，如不是油包水乳剂，应重新制备。
5、当抗原量过少不易提纯时，可采用抗原抗体在琼脂扩散中形成的沉淀线直接免疫动物制备抗体。
6、抗血清效价一般以抗血清稀释倍数表示。血清效价的检测方法很多，灵敏度各不同，因此在表示抗血清效价时，应标明检测方法。另外，在沉淀反应中，出现沉淀时的抗原、抗体比例有一较大的范围，如用不同浓度的抗原测定效价时，结果会因此有别，所以在测定抗血清效价时，需注意抗原的浓度。
7、分装保存的抗血清应注明抗血清的名称，效价，制备日期以及包装量。
