亲和层析实验：常规方法（三）
6.仿生配基
大部分的亲和层析配基是天然存在的，其优点在于具有高度选择性和强结合能力，但也存在某些缺点。这种配基稳定性低，需要进行纯化，使用过程中批间差异大，易被其他生物分子污染，对灭菌方法敏感，并且成本高。为了克服这些局限性，加速亲和层析在治疗性蛋白质纯化中的应用, 仿生型配基 (biomimetics)—合成亲和配基或变构的亲和配基已经成为研发重点，这是一种模仿天然生物配基结合方式和结构的物质。
活性纺织染料适用性强，呈现出多种竞争性生物分子具有的表面极性和空间构向性特征，可在水溶液中作为很多蛋白质的竞争性抑制剂、辅酶或效应分子，是应用最广泛的仿生配基之一 (MadoeryandMinchiotti,2006;Stellwagen，1”0)。包括应用最广泛的 CibacronBlueF3 G 染料在内，大多数仿生配基都含三嗉支架（triazinescaffold), 将其修饰后可以提高特异性，这也是仿生染料-配基概念的基础。在过去的几十年里，开发了充足的应用于蛋白质的广谱的，也即非特异性的纯化染料，包括针对血液蛋白（白蛋白）、还原酶、脱竣酶、糖酵解酶、核酸酶、水解酶、裂解酶、合成酶和转移酶等，并且将染料作为配基的亲和层析材料已经商品化 (表 26.2)(1^^0 11 抓~1 00 1^，1994;2002)。除了拓展商品化材料外，特制的仿生材料日显优越并逐渐普及。通过模拟靶蛋白中的肽段、天然生物识别基序或暴露表面的互补残基, 进而设计针对特异性靶蛋白的配基，这可通过设计合理的组合文库再经合成、筛选进行制备 (Ceciliaetal.，2005;Labrou,2003;Loweetal.，2001)。通过亲核取代反应在碱性条件下用载体表面的轻基取代染料中的氯，可以将含三嗪的染料固定在亲和介质 (如琼脂糖、葡聚糖和纤维素）上（Labrou，2000;LabrouandClonis，1994;Labrouetal.,1995)。
7.共价亲和层析
通常亲和层析是以靶分子与配基之间的可逆的相互作用为基础，但也可以通过共价相互作用分离特殊的 IE 分子（BlumbergandStrominger,1972；GEHealthcare,2007；Hage,2006) o 靶分子中的巯基与纯化介质上固定的活化巯基之间就是一种共价连接作用。可通过用 2-巯基乙醇、TCEP(乙基) 或二硫苏糖醇还原半胱氨酸的二硫键，洗脱结合的蛋白质。
最近研发了另一种以共价结合为基础的纯化，即特异性的氯化烷烃配基（chloroalkane)
和 HaloTag 蛋白之间的共价相互作用，如图 26.1 所示
(Losetal.，2008;Ohanaetal.，2009)。HaloTag 是一个 34kDa
单体蛋白融合标签，可以根据需要通过基因技术与蛋白质 C 端或 N 端融合。HaloTag 蛋白由细菌卤代掠经脱卤素酶
(haloalkanedehydroIase)
演变而来，首先对其活性位点进行修饰，以形成具有特异氯化烷烃配基的永久共价键。接着再通过突变增加蛋白质的稳定性,
并达到类似于生物素-链霉素的结合速率。在此基础上开发了一种基于 HaloTag 性质进行纯化的层析介质，即带有氯化烷烃配基的 HaloUnk
树脂。该层析介质对 HaloTag
融合蛋白的共价捕获结合速率快，克服了传统亲和纯化中平衡相关的局限性，能够实现对极低丰度靶蛋白的高效捕获。此外，这种层析介质可以接受多种严格的洗脱条件，不会损失结合的蛋白质。虽然共价联合有其优势，但在洗脱目标蛋白质方面也面临着挑战。由于
HaloTag 和氯化配基之间的共价键不可逆，因此不能利用传统方法从树脂上洗脱蛋白质。但是，目标蛋白质可以由特定的蛋白酶 (TEV) 释放,
其识别位点位于两个基团（HaloTag 和融合靶蛋白）之间。一旦被酶切，HaloTag 融合的蛋白质就会被释放，而 HaloTag
仍保持结合在树脂上，形成髙纯度的无标签蛋白（Urhetal.，2008)。
根据 HaloTag 自身的特性，除了前面描述的利用 HaloTag 纯化融合蛋白以外，还可以将 HaloTag 融合物固定作为亲和配基。类似于 ProteinG，可以用于纯化能与 Halo-Tag 融合蛋白特异性结合的抗体或其他蛋白质。该系统的优点在于，与其他共价固定技术不同，HaloTag 的固定化是通过活性位点进行单点吸附，因此可以定向。其他共价固定技术中蛋白质的结合是随机的，可能会导致多个吸附位点和定位不正确。单点定向吸附能力可增加系统的有效性和再生能力，HaloTag 融合物与介质共价结合, 可以改进特异性抗体纯化方法或 HaloTag 结合蛋白的分离方法。
三、化学吸附作用
一些传统介质，如脂糖、纤维素、二氧化硅、玻璃及合成的高分子支持物，其表面与亲和配基形成共价化学吸附，本节将简要回顾其中较常见的吸附形式。从策略上分析，化学吸附作用可以分为 3 个部分:①介质表面或树脂 (介质）；②连接组分或树脂活性的成分 (间隔）;③亲和配基。配基活性基团的类型和可用性限定了其如何与介质表面吸附。常见的基团是伯胺基、巯基和羧基。也可将配基修饰构建活性基团，如碳水化合物的氧化或正交活性基团的共价吸附，为配基的固定方式提供更多的选择。合成小分子的吸附策略趋于遵循与生物大分子相同的化学途径，但是在设计时往往也会有不同的考虑。
1.表面活化
制备共价亲和介质表面首先从表面活化开始。介质表面以两种方式接受配基，直接接受或通过活化连接物而接受配基，后者目的在于物理「隔离」配基与介质表面。表
26.3
总结了典型化学吸附，其中列出了已经构建的介质表面，并与用于吸附活化表面的配基主体进行对照。已经有多种已经商品化的预活化介质表面，所涉及的化学吸附类型多数可见表
26.3。如果配基表面已有合适的化学基团，那么其他要考虑的就可简化为明确最优的反应环境，这要权衡偶联反应发生的条件和影响配基稳定性的条件。大多数配基的偶联反应在水溶液中进行,
控制缓冲液的 pH，反应时间为 1~20 h, 反应温度介于 4°C
和室温之间。由于反应的异质性，浓度和混匀程度对确保反应物均一分布是非常重要的。尽可能保持反应的液相体积不超过树脂的 2
倍。配基浓度会因分子类型不同而变化, 但是对于蛋白质, 以 2.5~10 mg/mL 作为起始浓度是合适的。偶联反应可有较宽的 pH
和缓冲范围,
这取决于活化化学作用和配基活性（Hermanson，1992)。不同系统的表面活化效率各异，因此，封闭多余的表面反应基团以中和或降低非特异性反应是必要的。
