亲和层析实验：常规方法（四）
2.配基吸附
对于多肽、蛋白质或核酸，通常采用的共价吸附是, 通过胺反应将配基上的氨基吸附在树脂表面。溴化氰活化表面与伯胺发生反应形成亚胺碳酸盐是最常见的胺反应吸附。
最典型的伯胺是赖氨酸侧链（Hermanson,1992;PorathetaU1%7)(详见第 28 章）。这种活化形式的优点在于可以使用商业化的预活化树脂，与蛋白质的偶联效率几近 100%。
虽然过去一直普遍使用这种方法，但也存在许多缺点:①连接导致配基从树脂上脱落;②配基直接吸附到介质表面, 无间隔;③由于溴化氰具有毒性，需要增加安全防范。而且，可能需要通过交联限制这种固定方式存在的缺陷 (KorpelaandHinkkanen，1976;KowalandParsons，1980)。
酰胺键的共价吸附是一种替代溴化氰活化作用的方法，可以通过活化的羧基表面 (如羟基琥珀酯) 形成，或者用偶联试剂对羧基进行原位活化，如冲乙基 N-(3-二甲氨基) 碳二亚胺 (EDCKWilcheketal.，1984;1994)。另一种可选择的较稳定的方法是仲胺化连接。伯胺 (赖氨酸或 N 端) 和醛活化表面形成希夫碱 (Schiff 碱）中间体，后者经过还原烷基化形成仲胺。还原烷基化的吸附方法偶联条件温和，据报道与其他方法相比可以保留更多的酶活性，因此这种机制广泛应用于将酶固定于碳水化合物表面 (琼脂糖或纤维素）（Hermans o n，1992)~
胺反应连接也是小分子配基与介质表面吸附的常用方法。首要的是预先设计配基中用于吸附的胺基。很多可以用于胺固定的化学试剂也适用于硫氢基 (或硫醇基) 活化固定。在概念上, 巯基固定与胺基固定相同，但前者依赖于半胱氨酸与活性表面的反应。对于巯基特异性固定，两个最突出的策略是通过卤代乙烷 (碘或溴) 和马来酰亚胺活化介质表面 (Malliketal.,2007)。巯基连接反应是可逆的，这也是其优点。用还原剂如 DTT 或 TCEP 处理, 可去除表面的二硫键连接 (Brniaetal.，1993)。
可以通过前面介绍的方法将抗体或糖蛋白固定到表面，也可以采用修饰碳水化合物的方式，这种方法可能更具有定向性（Oatesetal.，1998;VijayendranandLeckband，2001)。通过碳水化合物固定，需要采用温和氧化物 (如髙碘酸盐) 使碳水化合物的糖残基发生成醛反应。氧化形成的醛用于将蛋白质或抗体固定至酰肼化表面。这种方法通常用于抗体、糖蛋白、糖聚合物和核糖核酸 (O’shannessyandWilchek,1 卯 0)。
在大多数情况下，采用前面讨论的活性基团中的一种进行配基吸附就足够了。但某些情况下，需要增加连接物与介质表面间隔的距离。一种方法是用间隔物对目的配基进行正交修饰，另一种活性集团会优先识别吸附在表面上的正交标签。这需要用合适的活性基团修饰表面和配基。目前常见的所谓「点击化学」(clickchemistry) 就是这种方法的具体体现，即铜 (I) 催化的叠氮末端炔烃化的 1，3 肩极环加成反应形成 1，2，3-三唑 (0^-dranetal.，2009;GauchetetaI.,2006)。这种方法的优点是，化学作用温和，具有独一无二的选择性，并且活性基团可以在配基和介质表面之间随意转换。由于反应本身需要催化，因此与常用的硫醇和胺标记后活性基团相比，反应基团本身更加稳定。
四、纯化方法
亲和纯化程序从适当处理样品和介质开始，接着是靶标的选择性结合 (捕获)，清洗除去非特异性背景，最后洗脱结合靶标。亲和纯化的成功取决于一些值得注意的因素，包括树脂上配基的数量和配基的可用程度、相互作用的强度以及固定蛋白质的完整性等。通常优化结合和清洗条件是为了将靶标及固定配基之间的反应最大化。然后从根本上转换成减弱相互作用的条件, 释放靶标。建议进行小规模实验，以选择最佳的纯化条件。下面章节简要概括一些常见的应用问题和影响亲和纯化的原因。
1.样品制备
制备纯化样品时, 选择的条件应能保持目的靶标适宜倍数和功能。强烈建议除去不溶物、降低黏度，因为这些因素都可能堵塞层析柱, 降低流速，增加反压。
一些蛋白质在高浓度时有聚合倾向，导致表观分子质量增加，降低扩散速率，减少亲和介质的捕获。此时，为了降低聚合, 增强对蛋白质的捕获和回收能力, 需要将样品或细胞裂解液稀释至较大体积。但是，如果样品太稀, 结合率和捕捉效率会降低，特别是对于低亲和力的结合物。
2.结合和洗漆
结合效率与蛋白质-配基间相互作用的强度和动力学相关，受到相互作用的特性、应用靶标的浓度、固定配基量及结合流速影响。式 (26.1) 为结合过程的简化，假设摩尔比为 I:1 时，Ka 为关联平衡常数，[L] 为配基浓度，[T] 为靶蛋白浓度，[LT] 为复合物浓度。
Ka=[LT]/([L]X[T]), 也可以表示为九/々 dA 为二阶联合速率常数，取决于 L 和 T 两者的浓度，&表示一阶解离常数，不依赖于配基浓度。Ka 为总靶标与结合靶标的比值，Ka 越高，吸附率越高，结合效率越髙。通常情况下，介质上配基的浓度为 KT4~10_2m o l/L。
艮值为 IO4~IO6mol/L 时, 可以实现有效结合。
通常在环境压力下，使样品缓慢流过用亲和介质装填的层析柱，可将其亲和固定至固相载体。一般来说，较高流速会降低结合效率, 特别是在配基与蛋白质间相互作用较弱或层析柱中的物质转移速率很慢时。结合程序也可以以直接混合的形式进行，将树脂和样品持续混合。尤其在处理大体积样品时，通常直接混合可以节省时间，有效地促进靶标和固定配基间的接触。但是，直接混合也会增加非特异性结合。在纯化过程中，优化树脂用量是很好的解决方法。在结合过程中，多余的树脂会增加非特异性结合，而且树脂的再吸附性会降低 IE 标回收率，因此要优选使结合靶标达到饱和的树脂用量。除非在某些特殊情况下才需要降低靶标回收率。
接下来的程序是洗涤。通过清洗去除非特异性结合的蛋白质。例如，通过增加盐浓度 (0.1~0■5mol/L) 或改变 pH 降低离子相互作用; 通过降低盐浓度, 改变 pH, 或加人表面活性剂 (如 TritonX-00) 去除疏水相互作用。也可用少量的竞争物去除与配基结合较弱的污染物。为了最大程度去除杂质，最小限度损失靶标, 应慎重决定清洗缓冲液的体积 (如 5~10 个柱体积) 和流速。
3.洗脱
实质上，从树脂上洗脱结合靶标是结合的可逆过程。因此优化条件降低 Ka，即可削弱靶标和配基之间的相互作用。洗脱条件不应使靶蛋白质变性, 除非这些条件与下游程序兼容。
有两种不同类型的洗脱方法，即特异性洗脱和非特异性洗脱。特异性洗脱过程中, 介质或竞争配基或竞争靶标，通过这种形式攻击蛋白质-配基复合物，继而将靶蛋白释放至溶液中。用于洗脱的竞争介质的浓度和量 (体积) 依赖于其亲和力，这种亲和力与固定复合物的亲和力相关。与亲和力强的添加物相比，竞争介质的结合越弱越需要更高的浓度和更大的体积。对于弱的竞争介质，比配基高 10 倍是较好的浓度起点。特异性洗脱通常是温和的，更可能保留蛋白质的活性。这种方法的缺点在于，洗脱慢，洗脱峰宽，需要从回收的蛋白质中去除竞争介质。对于非特异性洗脱，应控制溶剂条件降低关联速率常量 [式 (26.1)]，该常量应趋近于零，同时增加解离速率常量，进而削弱整体亲和力 (Ka), 导致复合物解离。根据配基与蛋白质之间的相互作用机制优化洗脱条件, 如增加盐的浓度、降低离子相互作用或通过改变 pH 来改变质子化/离子化状态，从而调节氢键强度、疏水相互作用及静电相互作用。从固定的 ProteinA 或 ProteinG 上洗脱抗体就是一个改变 pH 的例子。然而 ProteinA/ProteinG 与抗体的亲和力非常强 [Ka 为 lOVCmol/L)-1 左右)], 需要不同洗脱条件组合达到最大程度的抗体释放。通常, 亲和作用需要靶蛋白质正确地三维折叠，因此离液剂或影响蛋白质折叠的试剂可用于洗脱目标蛋白质，但是，必须注意保证耙标的正确折叠在洗脱后迅速恢复天然条件。当亲和力弱时，高浓度靶分子结合后，通过稀释以解离、洗脱复合物。这种方法即等度洗脱 (isocraticelution)。
