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亲和层析实验：常规方法（一）

2020.8.17

一、亲和介质的选择

亲和纯化的成功取决于是否选择了合适的固相载体和配基。理想的亲和介质 (如吸附配基的固相载体)应该具备孔隙大、理化性质高度稳定的特征。亲和介质可以选择性的捕获相应耙标，既保证较弱的非特异性吸附，又可以在整个过程中维持良好的流动特征。

优选介质应具备便宜、易获取和使用简便的特点。亲和介质可以是商品化的, 或通过适当的化学作用将配基吸附在固相载体上(详见本章第4节)。下文将详细讨论如何选择合适的亲和介质（GEHealthcare,2007;GustavssonandLarsson，2006;Zachariou，2007), 并对一些需要重点考虑的因素进行总结。

1.固相载体材料的基本特征

介质颗粒及孔隙应大小一致，且具有良好的流动性能。介质的表面积与孔隙呈负相关，这直接影响固定化配基数量，继而影响载量。孔隙与排阻限制相关，即一定尺寸范围或大小(分子质量)的蛋白质不能进入孔隙。大孔不受排阻限制作用的影响，允许大分子无阻碍地接近固定化配基，但会降低表面积和配基密度，进而降低纯化效率。根据Ren-kin方程(Renkin,1954)，孔隙的大小应该至少达到一个生物分子平均大小的5倍以上，才能更容易接近固定化配基。假设蛋白质平均大小为60A, 孔隙的大小应至少为 300人或更高。大多数常用载体都会满足这一要求(表 26.1)。交联可以增加一些软凝胶介质的机械稳定性，但会减少孔隙率(孔体积），进而降低连接配基数量和结合能力。在大多数情况下，应具体问题具体分析，综合考虑孔隙和表面积，以达到最佳应用效果。

此外，粒子的直径和粒度分布也是需要重点考虑的因素。理论上，较小颗粒更利于外部流动相和粒子内部间更快的物质转移, 流速高且保持高效的亲和捕获。但是会导致更高的流动阻力，发生粒子崩裂的概率更高，如对颗粒和样品中的变性蛋白质等污染物的敏感性增加导致高负压。很大程度上粒度的选择取决于分离目的和方法。10颗粒最适合用于 HPLC分离，400颗粒适合于制备样品。为避免较小颗粒填充空隙体积并限制流速，粒度分布应尽可能均一。

2.选择性

亲和介质的一个主要特点是其选择性。复杂样品中蛋白质的选择是特异性的，这是由偶联在介质上的特异性配基决定的, 其他组分与配基的结合作用是惰性的。由于通常用于离子强度低的溶液，所以支持物应具有亲水性并带有一定电荷, 但这些电荷也会导致负面的相互作用，即离子相互作用。很多商品化固相载体都可满足这些要求, 有的是其天然结构，有的表面包被合适的材料。常见载体(如球状琼脂糖和纤维素)都可以从供应商处购买，如GEHealthcare的琼脂糖凝胶(S印harose)、Bio-Rad的Affigel(表 26.1)。非特异性选择由固相载体自身特性决定，如聚苯乙烯珠的疏水性、二氧化硅表面的负电荷。

用于结合特殊配基时，应对介质进行修饰，此时也会导致非特异性吸附。针对这些情况，应根据靶标的特征精心设计、筛选并优化化学吸附作用、配基、配基和介质间隔物的选择性和效能, 同时降低非特异性结合。

3.稳定性

使用过程中，亲和介质的理化性质必须稳定，这样载体材料本身以及吸附的配基才不会与所用溶剂发生反应，样品中可能存在的酶和微生物也不会使其被降解或破坏。通常制造商会提供商品化亲和介质的化学相容性，应将其作为成功制订纯化程序的指导原则。

交联琼脂糖通常可以承受宽pH范围(如pH3~12)、大多数水溶剂 (包括变性剂）、有机溶剂、修饰剂和酶的作用。而如玻璃和二氧化硅等材料在碱性条件下会水解而不稳定，因此, 通常在吸附配基前需要在这些材料表面进行涂层。介质也应该能承受物理作用力 (如压力, 尤其是装柱时)并在纯化过程中保持不变。高压能够压缩介质, 使其崩裂。与较坚固的载体，如二氧化硅、聚苯乙烯和其他高度交联材料相比，琼脂糖珠及其他软凝胶介质更容易受到压力影响。

整体柱是孔隙大、非颗粒型的单一介质，可以用许多不同的材料制造，如琼脂糖凝胶、二氧化硅、GMA/EDMA、晶胶(cryogel)(MallikandHage,2006;Plievaaetal.，2009)。

整体柱除具有亲和载体很多必备的特性外，还有以下特点: 流穿孔隙大、没有无效体积、形成对流而非扩散以及髙流速缩短运行时程，并因此得到广泛应用。此外，在柱层析过程中，介质不会被压缩，压力塌陷较少，可承受较宽的 pH范围和剧烈的化学作用。但与传统介质相比，整体柱也具有局限性，如载量低，每种整体柱的亲和载体均需要特殊的制备程序，而且目前可用的亲和形式有限等(MallikandHage，2006)。

4.磁性亲和珠

通过在每个步骤中亲和珠的迅速再生(如结合、流穿、洗脱），磁性分离可显著缩短纯化过程，而且与传统的柱洗脱相比可减少样品的稀释倍数。黏性材料会堵塞层析柱, 可用该方法。磁性无需样品预处理(如离心或过滤)除去不溶物和微粒等物质，因此可以简化纯化过程。将磁性分离应用于高通量分析, 可以大大缩短纯化过程(Saiyedetal.,2003)。

这需要将其小型化，并且可以进行多条件平行筛选，如筛选适合蛋白质表达的生长条件和纯化用缓冲液。

顺磁颗粒(paramagneticparticle)存在修饰和不修饰两种形式。修饰通常采用亲和配基 (如链霉素、GSH.proteinA等)，或者偶联特异性识别的聚合物，如单克隆抗体和多克隆抗体(Konerackaetal.，2006)。除用于目标蛋白质纯化, 也用于固定，继而作为诱饵，从一个复杂的生物混合物中提取与其相互作用的分子。详见第16章。

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